СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 6-МЕТИЛЕНХОЛЕСТ-4-ЕН-3-ОНА, ОБЛАДАЮЩЕГО ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ, ИЗ ХОЛЕСТЕРИНА Российский патент 2025 года по МПК C07J75/00 C07J9/00 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, органической химии и фармацевтики, конкретно касается способа получения стероидного соединения ряда холестана, а именно 6-метиленхолест-4-ен-3-она формулы I, обладающего цитотоксической активностью, которое может представлять интерес для углубленного изучения его биологической активности с целью создания новых инновационных средств медицинского применения, а также может быть использовано в промышленной биотехнологии, химической и фармацевтической отраслях промышленности в качестве ключевого интермедиата в производстве стероидных медицинских препаратов из холестерина.

Уровень техники

В последние годы внимание исследователей обращено на изучение биологической активности природных соединений стероидной структуры, а также их химически модифицированных аналогов, с целью создания инновационных эффективных и безопасных лекарственных средств. Так, ранее было обнаружено, что холест-4-ен-3-он (холестенон), образующийся в толстом кишечнике из холестерина под действием ферментов микроорганизмов, обладает антибактериальной активностью, а именно эффективно ингибирует рост патогенного штамма Helicobacter pylori [Junichi Kobayashi et al. Cholestenone functions as an antibiotic against Helicobacter pylori by inhibiting biosynthesis of the cell wall component CGL, Proceedings of the National Academy of Sciences (2021). DOI: 10.1073/pnas.2016469118].

Получение холест-4-ен-3-она (холестенона) окислением 3β-гидроксильной группы кольца А молекулы холестерина с помощью микробной холестериноксидазы, сопровождаемое изомеризацией ∆⁵-связи в ∆⁴-связь с образованием ∆⁴-3-кето-системы, известно [CN 104357526 A, 2015; Characteristics and biotechnological applications of microbial cholesterol oxidases. Doukyu, N. // Appl. Microbiol. Biotechnol., 2009, 83, 825-837, doi: 10.1007/s00253-009-2059-8; Cholesterol oxidase and its applications. Kumari, L. and Kanwar, S.S. // Adv. Microbiol., 2012, 2, 49-65, doi: 10.4236/aim.2012.22007; Recombinant extracellular cholesterol oxidase from Nocardioides simplex. Fokina V.V., Karpov M.V., Kollerov V.V., Bragin E.Y., Epiktetov D.O., Sviridov A.V., Kazantsev A.V., Shutov A.A., Donova M.V. // Biochemistry (Moscow), 2022, 87 (9), 903-915, doi::10.1134/S0006297922090048].

Из уровня техники известны методы получения 6-метилен-Δ⁴-3-кетостероидов Введение С⁶-метиленовой группы в молекулу Δ⁴-3-кетостероида осуществляют различными методами, используя формальдегид или его производные как метиленирующие агенты. Известные способы также предусматривают обязательную предварительную енолизацию α,β-ненасыщенного кетона кольца А, необходимую для поляризации системы двойных связей с образованием нуклеофильного атома углерода С⁶.

Известны способы получения 6-метиленпроизводного холест-4-ен-3-она (6-метиленхолестенона, I).

Так, описан способ получения 6-метиленхолестенона из 3-этоксихолеста-3,5-диена через образование 3-этокси-6-формилхолеста-3,5-диена [Burn et al. Chem and Ind, 1962, 1908]. Описан способ получения 6-метиленхолестенона из 3-метоксихолеста-3,5-диена [J.S. E. Holker et al., J.C.S. Perkin I, 1978, 253] последовательностью, включающей реакцию последнего с реагентом Вильсмейера (фосфорилхлорид / диметилформамид) с образованием иминиевой соли, которую далее превращают гидролизом в 6-формильное производное, а именно в 3-метоксихолеста-3,5-диен-6-карбальдегид, который далее превращают реакцией восстановления в 3-метокси-6-гидроксиметилхолеста-3,5-диен, затем проводят деметилирование 3-метокси-группы и дегидратацию 6-гидрокси-метильного заместителя последнего.

Получение 3-этоксихолеста-3,5-диена описано в статье [Inhoffen, H.H.; Stoeck, G.; Kolling, G.; Stoeck, U. Justus Liebigs Annalen der Chemie (1950), 568, 52-63] и заключается в том, что реакцию холестенона с триэтилортоформиатом в среде бензола и абсолютного спирта в присутствии 15% раствора HCl в этаноле проводят при температуре 75°С в течение 2 ч, затем обрабатывают водным раствором NaOH и экстрагируют диэтиловым эфиром. После сушки экстракт упаривают, остаток кристаллизуют из ацетона или лигроина. Получают 3-этоксихолеста-3,5-диен с выходом 68,4%.

Получение 3-метоксихолеста-3,5-диена описано в статье [Just, G. and Leznoff, C.C. Canadian Journal of Chemistry (1964), 42 (1), 79-83] и заключается в том, что реакцию холестенона с триметилортоформиатом в среде диоксана в присутствии серной кислоты проводят при температуре кипения в течение 0,5 часа, затем добавляют пиридин, раствор упаривают, а полученное масло кристаллизуют из метанола. После перекристаллизации из смеси метанола и диэтилового эфира получают 3-метоксихолеста-3,5-диен с выходом 56%. Однако существенными недостатками известных способов получения 3-алкоксихолеста-3,5-диена являются проведение реакций енолэтерификации холестенона при температуре более 75°С и низкий выход целевого соединения.

Из уровня техники известны методы прямой конденсации 3-алкокси-3,5-диенола с формальдегидом или его производными замещением атома водорода при С⁶ на метиленовую группу с образованием 6-метилен-Δ⁴-3-кетостероидов. Так, известен метод прямого γ-метиленирования, предложенный К. Анненом и соавт. [US 4322349, 1982]. Однако этот метод не позволяет получать выход целевого продукта выше 45% [US 4990635, 1991]. Кроме того, примеры, описывающие применение холестенона как исходного ∆⁴-3-кето-стероидного субстрата, отсутствуют.

Также известен способ получения 6-метиленпроизводного из Δ⁴-3-кетостероида ряда прегнана или его 3-енолэфира и формальдегида методом прямой конденсации, которое осуществляется в присутствии первичного или вторичного амина без выделения промежуточного N-дизамещенного 6-аминометилпроизводного [DE 4121484, 1993]. Недостатком этого способа является необходимость очистки целевого соединения с применением хроматографии, существенно усложняющей технологический процесс, и низкий выход 6-метиленового производного - 23-48% согласно приведенным в описании примерам.

Таким образом, известные способы, которые заключаются в использовании методов прямой конденсации, описывают получение соединений рядов прегнана и андростана, и в них отсутствуют примеры получения соединений ряда холестана.

Известны способы получения 6-метилен-∆⁴-3-кетостероидов из Δ⁴-3-кетостероидов ряда андростана последовательностью, включающей образование 3-алкокси-3,5-диенолэфира и затем С⁶-аминометилпроизводного, без выделения указанных интермедиатов [US 4990635, 1991; CN 1415624, 2003; CN 1491957, 2004]. Однако недостатком известных способов является выход конечного продукта, не превышающий 75%. Кроме того, в известных способах не описано получение 6-метиленхолестенона из холестенона через образование 6-(N-метил-N-фенил)аминометилхолестенона и 6-(N,N-диметил)аминометилхолестенона, и нет никаких указаний на возможность их получения известными способами.

Известен способ конверсии 3-енолэфиров ∆⁴-3-кетостероидов, незамещенных в положениях 4 и 6, в соответствующие ∆⁴-3-кето-N,N-дизамещенные аминометилпроизводные, а затем в 6-метиленаналоги [GB 1280570, 1972]. Процесс получения 6-метилен-производного проводят смешением сильной кислоты и С⁶-аминометилпроизводного ∆⁴-3-кетостероида, полученного способом С⁶-аминометилирования ∆⁴-3-кетостероидов взаимодействием смеси вторичного амина, формальдегида и сильной кислоты с 3-алкокси-3,5-диенолэфиром [GB 1280569, 1972]. При этом в описании этого патента даны примеры, иллюстрирующие способ С⁶-аминометилирования ∆⁴-3-кетостероидов, с использованием стероидных соединений рядов андростана, 19-норандростана, прегнана, 19-норпрегнана, спиростана. Однако выходы полученных 6β-(N-метил-N-фенил)аминометил-продуктов не указаны, структуры заявленных соединений, а также конфигурация аминометильного заместителя при атоме С⁶, не подтверждены физико-химическими методами анализа.

Наиболее близким по сущности к предложенному способу получения 6-метилен-холестенона является способ получения 6-метиленгидрокортизона [RU 2664101, 2018], который заключается во введении 6-метиленовой группы в положение С⁶ молекулы 21-ацетата гидрокортизона последовательностью превращений, включающей защиту гидроксильной группы при атоме С¹¹, енолэтерификацию ∆⁴-3-кето-системы действием триалкилортоформиата в присутствии кислого катализатора с образованием 3-триалкоксиэфира ∆^3,5-3-гидроксипроизводного, конденсацию его с реагентом, полученным из формальдегида и вторичного амина в присутствии кислого катализатора с образованием смеси 6α- и 6β-изомеров 6-(N-метил-N-фенил)аминометил-производного, расщепление полученной смеси стероидных оснований Манниха по связи С-N действием протонной минеральной кислоты в присутствии солей галогеноводородной кислоты удаление защитных группировок 11β- и 21-гидроксильных групп полностью или частично. Однако в известном способе отсутствуют примеры получения 6-метиленхолестенона (I) через образование N,N-дизамещенных 6-аминометилхолестенона общей формулы VI, а именно, (6-(N-диметил)аминометил-холестенона (VIa) и 6-(N-метил-N-фенил)аминометил-холестенона (VIb)). Кроме того, в литературных источниках отсутствует информация о возможности их получения известными способами, включая взаимодействие с гидрохлоридами вторичных аминов общей формулы V.

Таким образом, техническая проблема, решаемая посредством заявляемого изобретения, заключается в необходимости преодоления недостатков, присущих аналогам и прототипу за счет создания простой и более эффективной последовательности стадий синтеза 6-метиленхолест-4-ен-3-она, обладающего цитотоксической активностью, из холестерина.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка простого и более эффективного способа получения 6-метиленхолест-4-ен-3-она из 3β-гидроксихолест-5-ена (холестерина) при обеспечении общего выхода целевого продукта не менее чем 84%.

Технический результат достигается способом получения 6-метиленхолест-4-ен-3-она формулы (I), обладающего цитотоксической активностью,

из холестерина формулы (II)

последовательностью превращений, включающей энзиматическое окисление 3β-гидроксильной группы кольца А молекулы холестерина (II), сопровождаемое изомеризацией ∆⁵-связи в ∆⁴-связь с образованием холест-4-ен-3-она (холестенона) формулы III,

взаимодействие соединения III с триалкилортоформиатом в присутствии кислого катализатора с образованием 3-алкоксихолеста-3,5-диена общей формулы IV;

где R₂=CH₃ или CH₂CH₃,

конденсацию соединения общей формулы IV с реагентом, образующимся in situ из формальдегида и вторичного амина общей формулы V,

где R₂=CH₃ или Ph,

в присутствии кислого катализатора или формальдегида и соли вторичного амина V c образованием N,N-дизамещенного 6-аминометилхолестенона общей формулы VI,

где R₂=CH₃ или Ph,

расщепление образованного N,N-дизамещенного 6-аминометилхолестенона. общей формулы VI по связи C-N.

Получаемые соединения общей формулы VI представляют собой смесь 6α- и 6β-диастереомеров или индивидуальные 6α-диастереомеры.

Реакция окисления 3β-гидроксильной группы молекулы холестерина (II) в 3-кето-группу, сопровождаемая изомеризацией 5,6-двойной связи кольца В в 4,5-двойную связь кольца А стероидной молекулы с образованием сопряженной Δ⁴-3-кето-системы, проводится с использованием ферментного препарата холестериноксидазы бактериального штамма Nocardioides simplex в присутствии циклического олигомера глюкозы, например метил-β-циклодекстрина, в среде Na-фосфатного буфера. Енолэтерификация Δ⁴-3-кетосистемы соединения III с образованием соединений общей формулы IV проводится взаимодействием соединения III с триалкилортоэфиром муравьиной кислоты в присутствии кислого катализатора в безводных условиях в соответствующем протонном растворителе (метаноле или этаноле). Как известно из уровня техники, в качестве растворителя также могут быть использованы безводные апротонные растворители, выбранные из группы циклических эфиров (например, диоксан или тетрагидрофуран) или ароматических углеводородов группы бензола (например, бензол или толуол). Реакция енолэтерификации Δ⁴-3-кетосистемы без применения растворителя может быть проведена в среде реагента, а именно триалкилортоформиата.

В качестве катализатора енолизации могут быть использованы любые протонные кислоты (неорганические и органические), обеспечивающие енолизацию Δ⁴-3-кетосистемы кольца А соединения III с образованием 3-алкокси-3,5-диенолэфира общей формулы IV, известные из уровня техники специалисту.

Конденсацию соединений общей формулы IV с реагентом, образующимся in situ из формальдегида и вторичного амина общей формулы V (N-метиланилина, N,N-диметиламина) или других вторичных аминов, известных из уровня техники и применимых для целей настоящего изобретения, то есть пригодных для образования 6-(N,N-дизамещенных)-аминометилхолестенона, проводят в присутствии кислого катализатора в среде протонного растворителя, в качестве которого используют алифатический спирт, например метанол или этанол. Конденсация с использованием гидрохлорида вторичного амина общей формулы V проводится без кислого катализатора.

Регионаправленное расщепление N,N-дизамещенных 6-аминометилхолестенона. общей формулы VI по связи C-N с образованием 6-метиленхолестенона (I) проводят действием концентрированных или разбавленных минеральных кислот, например, 30-35% соляной кислоты или 50-70% серной кислоты (предпочтительно 55-60% серной кислоты) в среде ароматического углеводорода ряда бензола (толуола или бензола) с добавлением апротонного растворителя, смешивающегося с водой, например диалкилкетона (ацетона или метилэтилкетона) или циклического эфира (диоксана или тетрагидрофурана). Реакция регионаправленного расщепления стероидного основания Манниха общей формулы VI по связи С-N может быть проведена в присутствии минеральных солей, например галогенидов щелочных или щелочноземельных металлов, или галогенидов аммония.

Простота и эффективность способа получения 6-метиленхолест-4-ен-3-она формулы I из 3β-гидроксихолест-5-ена (холестерина) формулы II достигается за счет:

1) проведения ферментативного окисления 3β-гидроксильной группы молекулы холестерина (II) в 3-кето-группу с одновременной изомеризацией Δ⁵-связи в Δ⁴-связь с образованием холест-4-ен-3-она (холестенона, III);

2) проведения последовательных реакций функционализации положения С⁶ молекулы холестенона (III) с образованием 6-метиленхолестенона (I);

3) возможности проведения непрерывного технологического процесса окисления холестерина (II) в холестенон (III), функционализации положения С⁶ молекулы холестенона (III) без выделения интермедиатов IV и VI с образованием целевого продукта (I) на ключевых стадиях синтеза и исключения тем самым не только потерь указанных интермедиатов III, IV и VI в маточных растворах, но и механических потерь, которые обычно имеют место на технологических операциях экстракции, фильтрации, сушки и т.п.;

4) достижения практически полной конверсии исходных продуктов и высокой селективности реакций образования интермедиатов III, IV и VI и целевого продукта I в процессах окисления 3β-гидроксильной группы холестерина, функционализации положения С⁶ молекулы холестенона (III) и тем самым снижения вероятности протекания побочных реакций.

Эффективность заявленного способа получения 6-метиленхолестенона (I) из холестерина (II) позволяет существенно упростить технологический процесс путем объединения 4-х стадий химического синтеза в одну технологическую стадию (вариант 2 схемы) и тем самым сократить количество технологических операций на этапах синтеза интермедиатов, что, в свою очередь, приводит не только к сокращению единиц используемого оборудования и суммарной продолжительности проведения процесса, но и к существенному сокращению материальных затрат на реактивы, растворители и другие расходные материалы. Например, возможность применения на стадии конденсации товарного гидрохлорида вторичного амина общей формулы V c образованием N,N-дизамещенного 6-аминометилхолестенона общей формулы VI позволяет исключить применение кислого катализатора. Минимизация трудозатрат и затрат времени и средств демонстрирует явные преимущества заявляемого способа перед известными аналогами.

В результате достигается высокий выход конечного продукта I, (от 84 до 95%), считая из холестерина (II).

Таким образом, заявленный способ получения 6-метиленхолестенона (I) из холестерина (II) через образование N,N-дизамещенных производных 6-аминометилхолест-4-ен-3-она общей формулы VI является новым, в доступных литературных источниках не описан. N,N-Дизамещенные производные 6-аминометилхолестенона общей формулы VI (6-(N-диметил)аминометил-холестенон (VIa) и 6-(N-метил-N-фенил)аминометил-холестенон (VIb)) являются новыми соединениями, в литературе не описаны. N,N-дизамещенные производные 6-аминометилхолестенона общей формулы VI могут представлять собой смесь 6α- и 6β-диастереомеров или индивидуальные 6α-диастереомеры, а именно 6α-(N,N-диметил)аминометил-холестенона (α-VIa), и 6α-(N-метил-N-фенил)аминометил-холестенонa (α-VIb), которые являются новыми соединениями, в литературе не описаны.

В доступных источниках литературы данные об изучении биологической активности 6-метиленхолестенона (I) отсутствуют. Впервые обнаружено, что 6-метиленхолестенон (I) обладает цитостатической активностью.

Ниже представлена заявляемая схема синтеза 6-метиленхолестенона (I) из холестерина (II).

Схема синтеза 6-метиленхолестенона (I) из холестерина (II)

Химическая схема синтеза включает 4 химических реакции: 1) окисление 3β-гидроксильной группы кольца А молекулы холестерина (II), сопровождаемое изомеризацией ∆⁵-связи в ∆⁴-связь, с образованием холестенона (III); 2) енолизацию α,β-ненасыщенного кетона кольца А соединения III с образованием 3,5-диенолэфира (IV); 3) реакцию трехкомпонентной конденсации по типу реакции Манниха с образованием диастереомерной смеси С⁶-аминометильных производных (VI) или индивидуальных α-диастереомеров; 4) расщепление аминометильных производных (VI) по связи C-N с образованием 6-метиленхолестенона (I), при этом дезаминирование диастереомерной смеси соединений общей формулы VI может быть проведено в среде апротонного растворителя или смеси апротонных растворителей действием разбавленной серной кислоты с использованием эффективного ее количества.

Сущность заявленного изобретения, касающегося получения 6-метиленхолестенона (I), заключается в том, что с целью повышения выхода и упрощения процесса холестерин (II) сначала подвергают ферментативному окислению 3β-гидроксильной группы, сопровождающемуся изомеризацией Δ⁵-связи в Δ⁴ с образованием α,β-ненасыщенного кетона в кольце А, затем метиленированию положения С⁶ с образованием целевого 6-метилен-производного (I).

Преимущества заявляемого способа состоят в следующем:

- проведение селективного окисления холестерина (II) с образованием холестенона (III) осуществляется в одну химическую стадию с применением ферментного препарата рекомбинантной холестериноксидазы бактерий Nocardioides simplex при исходной концентрации субстрата 5 г/л.

- региоселективность расщепления стероидного основания Манниха минеральной кислотой исключительно по связи С-N обеспечивается присутствием в реакционной среде соли галогенводородной кислоты и щелочного, или щелочноземельного металла, или аммония.

- отсутствие необходимости использования многократной кристаллизации 6-метиленхолестенона (I) или хроматографирования с целью его очистки, так как содержание основного вещества в продукте составляет 90-95% (ВЭЖХ), что соответствует требованиям, например, процессов деградации боковой цепи стерина с образованием соединений ряда андростана или прегнана микробиологическим методом. Продукт также может быть использован в химическом процессе каталитической изомеризации 6-экзометиленовой двойной связи в 6,7-эндометиленовую двойную связь, а также в процессе каталитического гидрирования с образованием 6α-метилхолестенона, без дополнительной очистки.

- значительное сокращение потерь основного продукта на стадиях, которое обеспечивается высокой селективностью химических реакций, что дает возможность совмещать химические стадии в один технологический процесс без выделения интермедиатов и тем самым позволяет существенно увеличить общий выход 6-метиленхолестенона (I) из холестерина (II) до 95%.

Синтез 6-метиленхолест-4-ен-3-она (I) из холестерина (II) включает четыре последовательных химических процесса, которые могут быть проведены с выделением промежуточных соединений III, IV и VI (вариант схемы 1), без их выделения (вариант схемы 2), а также с выделением любого из них, а именно: с выделением соединения III с проведением последующих стадий синтеза без выделения интермедиатов IV и VI (вариант схемы 3); или без выделения соединений общей формулы IV (вариант схемы 4), или без выделения соединений общей формулы VI (вариант схемы 5).

Возможные варианты химической схемы синтеза:

Вариант схемы 1: II - III - IV - VI - I; или

Вариант схемы 2 II - [III] - [IV] - [VI] - I; или

Вариант схемы 3 II - III - [IV] - [VI] - I; или

Вариант схемы 4 II - III - [IV] - VI - I, или

Вариант схемы 5 II - III - IV - [VI] - I; или

Наиболее оптимальным и предпочтительным является вариант схемы 2.

На первом этапе синтеза проводится реакция энзиматического окисления 3β-гидроксильной группы молекулы холестерина (II) в 3-кето-группу действием холестериноксидазы бактерии Nocardioides simplex, сопровождаемое изомеризацией 5,6-двойной связи кольца В в 4,5-двойную связь кольца А стероидной молекулы с образованием сопряженной Δ⁴-3-кето-системы, при этом реакция энзиматического окисления может быть проведена без выделения холестенона (III). Реакцию энзиматического окисления проводят с концентрацией соединения II в реакционной смеси не менее 5 г/л (12,72 ммоль/л) с применением минимальной необходимой концентрации фермента: 172 мкг белка/мл реакционной смеси (что соответствует количеству 483-500 ед. рекомбинантной холестериноксидазы на 1 моль холестерина), необходимой для полного превращения исходного соединения в присутствии минимально необходимого количества циклического олигомера глюкозы. На втором этапе синтеза для повышения нуклеофильности атома С⁶ и тем самым уменьшения вероятности протекания побочных процессов конденсации по другим реакционным центрам (например, по атому С²) проводится реакция енолизации Δ⁴-3-кетосистемы кольца А соединения III с образованием 3-алкокси-3,5-диенолэфира общей формулы IV. Реакция енолэтерификации Δ⁴-3-кетосистемы кольца А может быть проведена без выделения 3-алкокси-3,5-диенолэфира общей формулы IV из реакционной массы. Реакцию енолэтерификации Δ⁴-3-кетосистемы проводят действием триалкилортоэфира муравьиной кислоты (например, триметилортоформиата или триэтилортоформиата) с использованием минимального количества триалкилортоформиата, необходимого для обеспечения протекания реакции (не менее 1 моля на 1 моль стероида). Для более полного и быстрого протекания реакции (15-30 мин, но не более 1 ч) используется избыток алкилортоформиата (от 2,5 до 7 моль на 1 моль стероида). Однако это условие не является обязательным. Реакция проводится в безводных условиях в соответствующем протонном растворителе - алифатическом спирте (в метаноле или этаноле). В качестве кислотного катализатора, обеспечивающего енолизацию Δ⁴-3-кетосистемы кольца А соединения III с образованием 3-алкокси-3,5-диенолэфира IV, предпочтительно использовать органические кислоты, например, сульфоароматические (сульфосалициловую кислоту, п-ТСК или т.п.) как безводные, так и в виде кристаллогидрата. При проведении реакции без выделения 3-алкокси-3,5-диенолэфира общей формулы IV из реакционной массы предпочтительно использовать п-ТСК, которая является также катализатором последующей реакции аминометилирования.

На третьем этапе в синтезе соединений общей формулы VI введение заместителя в положение С⁶ осуществляют методом трехкомпонентной конденсации по типу реакции Манниха с применением реагента Манниха, образованного in situ взаимодействием 30-40% водного раствора формальдегида и вторичного амина общей формулы V (N-метиланилина, N,N-диметиламина) или его гидрохлорида. Известно, что реакция аминометилирования по типу реакции Манниха в жестко сочлененных полициклических структурах, к которым относятся стероиды, нестереоселективна и протекает с образованием смеси 6α- и 6β-диастереомеров (α-VI и β-VI соответственно) [RU 2425052, 2011; RU 2663483, 2018]. Реакция дезаминирования не требует разделения смеси изомеров, так как оба изомера подвергаются последующей реакции дезаминирования с образованием целевого 6-метиленхолестенона (I). Однако при необходимости 6β-диастереомер может быть изомеризован в 6α-аналог без выделения смеси диастереомеров из реакционной массы.

На четвертом этапе для проведения реакции дезаминирования без выделения смеси изомеров α-VI и β-VI раствор смеси стероидных оснований Манниха (VI) в ароматическом углеводороде разбавляют минимально необходимым количеством диалкилкетона (не менее 40% об.), добавляют 55-60% раствор серной кислоты и минеральную соль. По окончании реакции реакционный раствор промывают от кислоты. Растворитель упаривают. Остаток ароматического углеводорода может быть удален азеотропной отгонкой с любым удобным растворителем, образующим азеотропную смесь с ароматическим углеводородом и смешивающимся с водой, например, с этиловым или метиловым спиртом. Выделение продукта реакции осуществляют растворением остатка после отгонки в спирте (этиловом или метиловом) и разбавлением полученного раствора водой.

Достигаемый выход 6-метиленхолестенона (I) из холестерина (II) составляет:

по варианту 1 (II - III - IV - VI - I) - от 84 до 92,3%;

по варианту 2 (II - [III] - [IV] - [VI] - I) - от 88,3 до 95%.

Образование 6-метиленхолест-4-ен-3-она (I) из смесей изомерных стероидных оснований Манниха (смеси 6α- и 6β- диастереомеров) в результате трехкомпонентной реакции конденсации подтверждено данными спектров ЯМР ¹Н.

Получают 6-метиленхолестенон (I) с содержанием основного вещества 90-95% (ВЭЖХ), что соответствует требованиям, например, процессов деградации боковой цепи стерина с образованием соединений ряда андростана или прегнана микробиологическим методом. Продукт также может быть использован в химическом процессе каталитической изомеризации 6-экзометиленовой двойной связи в 6,7-эндометиленовую двойную связь, а также в процессе каталитического гидрирования с образованием 6α-метилхолестенона, без дополнительной очистки.

Заявленное изобретение иллюстрируется представленными ниже примерами по варианту схемы 1 и по варианту схемы 2, а именно с выделением или без выделения интермедиатов соответственно. Специалисту в области химии понятно, что синтез может быть осуществлен с выделением любого из интермедиатов в условиях примеров схемы 1. Продолжительность реакций указана только для иллюстрации. Выход продуктов приведен только для иллюстрации. Соотношение 6α- и 6β- изомеров соединений общей формулы VI не указано, так как оно может варьировать в зависимости от условий кристаллизации и очистки. Применение неорганических солей приведено только для иллюстрации. Вместо указанных солей могут быть использованы любые растворимые в воде соли, образованные галогенводородными кислотами, например, хлориды и бромиды лития, натрия, калия, магния, кальция, бария, аммония и другие, без потери эффективности.

Результаты тестирования цитотоксической активности 6-метиленхолестенона (I) методом МТТ-теста, а именно исследования темновой и фототоксичности, на панели культивируемых линий опухолевых и неопухолевых клеток человека в сравнении с холестерином (II), холестеноном (III) и 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-дионом (эксеместаном - активным фармацевтическим ингредиентом стероидной структуры противоракового препарата «Аромазин»), приведены для иллюстрации наличия цитотоксического действия у заявляемого соединения.

Осуществление изобретения

Холестерин (II), CAS № 57-88-5, C₂₇H₄₆O (≥99,0%), является коммерчески доступным, может быть приобретен, например, у компании Merck (Sigma-Aldrich^® Brand), или у других поставщиков и производителей. Использован метилированный β-циклодекстрин (МЦД, CAS No. 128446-36-6) компании Wacker-Chemie (Германия). Триметилортоформиат (≥99,0%, CAS № 149-73-5), триэтилортоформиат (≥98,0%, CAS № 122-51-0), 5-сульфосалициловая кислота (≥99,0%, CAS № 5965-83-3), п-толуолсульфокислота (≥98,0%, CAS № 6192-52-5), N-метиланилин (≥98,0%, CAS № 100-61-8), N-метиланилин гидрохлорид (98%, CAS № 2739-12-0), диметиламин гидрохлорид (99%, CAS № 506-59-2), триэтиламин (≥99,0%, CAS № 121-44-8) являются коммерчески доступными, могут быть приобретены, например, у компании Sigma-Aldrich Co или у других поставщиков и производителей. Другие реагенты, растворители являются коммерчески доступными, были приобретены у российских производителей.

Ферментный препарат рекомбинантной холестериноксидазы (ХО) Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д был получен, как описано в работе [Recombinant extracellular cholesterol oxidase from Nocardioides simplex. Fokina Victoria V. et al. Biochemistry (Moscow). 2022, V. 87 (9). P. 903-915. DOI:10.1134/S0006297922090048].

Ферментный препарат в 50 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 100 мМ NaCl и 50% глицерина (по массе), хранили при температуре минус 20°С. Концентрация препарата составляла ~10-11 мг белка/мл. Удельная активность ферментного препарата рекомбинантной ХО (теоретический максимум) составляла 100 Ед./мг, практическая (при рН 7,0) - 35 Ед./мг.

Энзиматическое окисление 3β-гидроксильной группы кольца А молекулы холестерина (II) с образованием холест-4-ен-3-она формулы III проводят с использованием в качестве катализатора рекомбинантной холестериноксидазы бактерий Nocardioides simplex в количестве 172 мкг белка/мл реакционной смеси, что соответствует 483-500 ед. рекомбинантной холестериноксидазы на 1 моль холестерина, необходимом для полного превращения исходного соединения II.

Для выделения продуктов по окончании реакций выливанием реакционных масс в воду, а также для промывки осадков, экстрактов в органических растворителях, использовали питьевую водопроводную воду, если не оговорено особо. Для приготовления водных растворов щелочей использовали дистиллированную воду.

Все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 20 до 25°C. Для процессов, требующих более низкие температуры, чем комнатная, охлаждение обеспечивали холодной водопроводной водой (в диапазоне от 10 до 20°С), или смесью колотого льда и холодной воды (в диапазоне от 5 до 10°С). Для обогрева при проведении реакций при температуре выше комнатной и для упаривания растворителей при атмосферном давлении использовали электрический колбонагреватель.

Упаривание растворителей в вакууме осуществляли с использованием ротационного вакуумного испарителя Rotavapor (Büchi Labortechnik AG), при остаточном давлении 0,35±0,05 кгс/см² и температуре воды в бане в диапазоне от 35-50°C в зависимости от природы упариваемого растворителя.

Высушивание кристаллов продуктов до постоянного веса осуществляли при температуре 35-45°C при атмосферном давлении или с использованием вакуум-сушильного шкафа при остаточном давлении 0,35±0,05 кгс/см².

Для определения рН промывных вод использовали универсальную индикаторную бумагу с диапазоном значений от 0 до 12 (Лахема, Чехия).

Сухие (безводные) растворители (триэтиламин, дихлорметан, метанол, этанол и др.) получали общеизвестными методами органической химии.

Колоночную хроматографию осуществляли на колонке (16 × 650 мм), используя силикагель марки Silica gel 60 (0,040-0,063 мм) (Merck, Germany).

Контроль за ходом реакций осуществляли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), используя пластины Silica gel 60 F254 (Merck, Germany).

Структуру и чистоту всех выделенных соединений подтверждали, по меньшей мере, одним из следующих методов: ТСХ, масс-спектрометрия, элементный анализ, ядерный магнитный резонанс (ЯМР), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Температуру плавления выделенных соединений определяли на приборе для определения точки плавления M-565 (Büchi Labortechnik AG).

¹Н- и ¹³С- ЯМР спектры были определены на спектрометре Bruker Avance-400 (Bruker BioSpin GmbH) с рабочей частотой 400 МГц и 100.6 МГц соответственно, используя дейтерированный хлороформ (99,8% D, Sigma-Aldrich), или дейтерированный диметилсульфоксид (99,9% D, Sigma-Aldrich) в качестве растворителя относительно тетраметилсилана (TMS NMR grade ≥99,9%, Sigma-Aldrich) в качестве внутреннего стандарта, в миллионных долях (м.д.).

Элементный анализ был выполнен с использованием анализатора Vario MICRO Cube (Elementar Analysensysteme, GmbH).

ВЭЖХ-анализ проводили на хроматографе Knauer Smartline (Germany), укомплектованном градиентным HPLC-насосом, ячейкой для термостатированной колонки, инжектором, диодно-матричным детектором Smartline 2600, интегратором-компьютером, при температуре 24°C, скорости потока 1 мл/мин и УФ-детектировании при длине волны 254 нм. В качестве неподвижной фазы использовали Kromasil® 100-5C18, в качестве мобильной фазы - 35% (по объему) раствор H₂O в ацетонитриле.

А. Схема, вариант 1: II - III – IV – V - I

Пример 1. Получение холест-4-ен-3-она (III)

Ферментативное превращение холестерина (II) в холест-4-ен-3-он (III) проводили, используя ферментный препарат ХО N. simplex. Для этого 1,5 г (3,88 ммоль) холестерина (II) растворяли в 300 мл 0,1 М Na-фосфатного буфера (рН 7,0), содержащего 26,136 г (19,4 ммоль) метил-β-циклодекстрина (МЦД), и добавляли 5 мл раствора ферментного препарата с концентрацией белка ~10-11 мг белка/мл в 50 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 100 мМ NaCl и 50% глицерина. При этом концентрация холестерина в реакционной массе составляла ~5 г/л (12,72 ммоль/л), концентрация фермента - 172 мкг белка/мл реакционной смеси (что соответствует количеству 483-500 ед. рекомбинантной холестериноксидазы на 1 моль холестерина), необходимого для полного превращения исходного соединения. В качестве контроля использовали реакционную смесь с добавлением 5 мл дистиллированной воды вместо ферментного препарата.

Реакционную массу и контрольный раствор выдерживали при комнатной температуре (22±2°С). Трансформацию проводили в течение 12 ч, сохраняя в тех же условиях контрольные растворы без фермента. Каждый эксперимент проводили в трех технических повторностях, включая контрольный.

Отбирали пробы через определенные промежутки времени. В пробах реакцию останавливали, выдерживая пробы при температуре 80°С в течение 5 минут. Стероиды экстрагировали этилацетатом, анализ стероидов проводили методом ТСХ и ВЭЖХ.

По окончании трансформации реакционную массу разбавляли этилацетатом в соотношении 0,5:1 к объему реакционной массы и выдерживали при интенсивном перемешивании и комнатной температуре (22±2°C) в течение 0,5 часа. Органический слой отделяли. Экстракцию повторяли трижды. Объединенный этилацетатный экстракт промывали водой. Растворитель упаривали в вакууме до прекращения погона. Кристаллизующийся остаток растирали в смеси метанол-вода 1:1 об. Осадок отфильтровывали, промывали на фильтре водой, высушивали до постоянного веса. Получали 1,454 г (3,78 ммоль) соединения III с выходом 97,4%. Т.пл. 80-82°С (лит. т.пл. 81-82°С [G. Just and JU ST and C.C . Leznoff. Can.J.Chem.. Vol. 42 (1964]).

Пример 2. Получение 3-метоксихолеста-3,5-диена (IVа, R=CH₃)

К суспензии 5,42 г (14,091 ммоль) холестенона (III) в смеси 8 мл сухого метанола и 8,1 мл (7,838 г, 73,85 ммоль) триметилортоформиата добавляли 0,1 г (0,526 ммоль) безводной п-толуолсульфокислоты (п-TСK). Реакционную массу перемешивали в течение 30 мин при температуре (30±2)°С. По окончании реакции в реакционную массу добавляли 1 мл 10% раствора NaOH в метаноле до рН ~8. Суспензию разбавляли 20 мл метанола и добавляли 10 мл воды, затем выдерживали при перемешивании и комнатной температуре в течение 30 мин. Осадок отфильтровывали, промывали на фильтре смесью, содержащей 20 мл метанола, 10 мл воды и 0,1 мл 10% раствора NaOH в метаноле, и водой до рН ~ 7 промывной воды. Осадок высушили до постоянного веса. Получили 5,59 г (14,015 ммоль) соединения IVa с выходом 99,46% в виде кристаллов белого цвета. Т.пл. 68-68,5°C (с разл.) (лит. т.пл. 67-68°C [Just, G. and Leznoff, C.C. Canadian Journal of Chemistry (1964), 42(1), 79-83]).

ЯМР ¹Н (400 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 5.25 (м, 1Н, Н-6), 5.13 (уш.с, 1Н, Н-4), 3.57 (с, 3Н, OCH₃), 0.97 (с, 3H, 19-CH₃), 0.92 (д, J = 6.5 Гц, 3H, 21-CH₃), 0.87 (д, J = 6.6 Гц, 3H, 26(27)-CH₃), 0.86 (д, J = 6.6 Гц, 3H, 26(27)-CH₃), 0.70 (с, 3H, 18-CH₃).

ЯМР ¹³C (100.6 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 155.2 (C-3), 140.8 (C-5), 118.5 (C-6), 98.5 (C-4), 56.9, 56.1, 54.2 (OCH₃), 48.3, 42.4, 39.8, 39.5, 36.2, 35.8, 35.3, 33.8, 31.8, 28.2, 28.0, 25.3, 24.2, 23.8, 22.8, 22.5, 21.2, 18.9, 18.7, 12.0.

Пример 3. Получение 3-этоксихолеста-3,5-диена (IVb, R=СН₂CH₃)

В условиях получения соединения IVa (пример 2), используя 5 мл безводного этанола и 2 мл (2,019 г, 13,624 ммоль) триэтилортоформиата, из 1 г (2,6 ммоль) холестенона (III) получали 1,014 г (2,457 ммоль) соединения IVb с выходом 94,5%. Т.пл. 96°C (с разл.) (лит. т.пл. 95°C [Schwenk, E.; Fleischer, G.; Whitman, B.J. Am. Chem. Soc., 1938, 60(7), 1702-1703]).

ЯМР ¹Н (400 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 5.22 (м, 1Н, Н-6), 5.11 (уш.с, 1Н, Н-4), 3.77 (м, 2Н, OCH₂), 1.30 (т, J = 6.9 Гц, 3Н, CH₂CH₃), 0.97 (с, 3H, 19-CH₃), 0.92 (д, J = 6.5 Гц, 3H, 21-CH₃), 0.87 (д, J = 6.6 Гц, 3H, 26(27)-CH₃), 0.86 (д, J = 6.6 Гц, 3H, 26(27)-CH₃), 0.70 (с, 3H, 18-CH₃).

ЯМР ¹³C (100.6 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 154.4 (C-3), 141.0 (C-5), 118.2 (C-6), 99.0 (C-4), 62.1 (OCH₂), 56.9, 56.1, 48.3, 42.4, 39.8, 39.5, 36.2, 35.8, 35.2, 33.8, 31.8, 28.3, 28.0, 25.5, 24.2, 23.8, 22.8, 22.5, 21.2, 18.9, 18.7, 14.7, 12.0.

Пример 4. Получение 6ξ-( N,N -диметил)аминометилхолест-4-ен-3-она (VIа)

К суспензии 3,7 ммоль 3,5-диенолэфира (IVa или IVb) в 30 мл 95% этилового спирта добавляли 3,2 г диметиламина гидрохлорида (3,17 г в 100% исчислении, 38,9 ммоль). Затем при перемешивании добавляли 3 мл (3,27 г, 1,21 г в 100% исчислении, 40,29 ммоль) 37%-ного водного раствора формальдегида. Реакционную массу перемешивали при температуре (45±5)°С в течение 2 ч. По окончании реакции в реакционную массу добавляли по каплям 20% водный раствор NaOH до рН 8-9 и 90 мл воды при интенсивном перемешивании. Продукты экстрагировали бензолом, экстракт промывали водой до рН ~ 7 промывной воды, растворитель упаривали до прекращения погона, Остаток растворили в метаноле, метанольный раствор разбавили 10-кратным количеством воды. Осадок отфильтровывали, промывали водой до рН ~ 7 промывной воды, высушивали до постоянного веса. Получали соединение VIа (смесь 6α- и 6β- изомеров) с количественным выходом.

Для получения аналитически чистого образца использовали метод колоночной хроматографии на SiO₂, предварительно обработанном триэтиламином, используя дихлорметан в качестве элюента.

Пример 5. Получение 6α-( N,N -диметил)аминометилхолест-4-ен-3-она (α-VIа)

Вариант 1

Реакцию трехкомпонентной конденсации проводили условиях примера 4, используя 3,0 г (7,525 ммоль) 3,5-диенолэфира IVa. По окончании реакции в реакционную массу добавляли по каплям 5% раствор сульфосалициловой кислоты в этаноле до рН 1-2. Реакционную массу выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут, затем добавляли по каплям 20% водный раствор NaOH до рН 8-9 и разбавляли водой. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали водой до рН ~ 7 промывной воды, высушили до постоянного веса. Получали 7,36 г соединения α-VIа с выходом 97,8%.

Вариант 2

К раствору 1 г (2,264 ммоль) соединения VIa (смесь 6α- и 6β- изомеров, 1:1,5) в 3 мл метилового спирта добавляли 5% раствор HCl в метаноле медленно по каплям в течение 5-10 минут до рН 1-2. Реакционную массу выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут, затем разбавляли 21 мл воды и добавляли 20% водный раствор NaOH до рН 8-9. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали водой до рН ~ 7 промывной воды, высушили до постоянного веса. Получали 0,98 г соединения α-VIа с выходом 98%. Т.пл. = 82-84°C.

6α-Изомер (α-VIa), ЯМР ¹Н (400 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 5.76 (м, 1H, H-4), 2.22 (с, 6H, (CH₃)₂N), 1.18 (с, 3H, 19-CH₃), 0.92 (д, J = 6.5 Гц, 3H, 21-CH₃), 0.87 (д, J = 6.6 Гц, 3H, 26(27)-CH₃), 0.86 (д, J = 6.6 Гц, 3H, 26(27)-CH₃), 0.73 (с, 3H, 18-CH₃).

ЯМР ¹³C (100.6 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 199.9 (C-3), 172.9 (С-5), 126.2 (C-4), 65.3, 56.1, 55.9, 53.4, 45.9, 42.4, 42.3, 39.6, 39.5, 38.3, 37.5, 36.1, 35.7, 34.1, 34.0, 30.8, 28.1, 28.0, 24.3, 23.8, 22.8, 22.5, 20.9, 19.1, 18.6, 12.1.

Найдено: С 81,49%; Н 11,77%, N 3,14%,

C₃₀H₅₁NO. Вычислено: С 81,57%; Н 11,64%, N 3,17%.

Пример 6. Получение 6ξ-( N -метил- N -фенил)аминометилхолест-4-ен-3-она (VIb)

Вариант 1

К суспензии 2,3 ммоль 3,5-диенолэфира (IVa или IVb) в 80 мл абсолютного спирта (метилового или этилового соответственно) добавляли 1,9 мл (1,875 г, 17,5 ммоль) N-метиланилина и 1,09 мл (1,212 г, 0,448 г в 100% исчислении, 14,93 ммоль) 37% водного раствора формальдегида. Затем при перемешивании добавляли по каплям раствор 0,1 г (0,581 ммоль) п-ТСК в 3 мл соответствующего спирта. Реакционную массу перемешивали при температуре (45±5)°С в течение 30 мин. По окончании реакции в реакционную массу добавляли по каплям 20% водный раствор NaOH до рН 8-9 и 90 мл воды при интенсивном перемешивании. Продукты экстрагировали бензолом, экстракт промывали водой до рН ~ 7 промывной воды, растворитель упаривали до прекращения погона, остаток растворяли в 10-кратном количестве смеси метанола и ацетона (1:1) по объему. Полученный раствор добавляли по каплям в 10-кратное количество воды по объему смеси растворителей. После выдерживания полученной суспензии при температуре 10-15°С без перемешивания в течение 1 часа осадок отфильтровывали, промывали на фильтре водой, сушили до постоянного веса. Получали соединение VIb (смесь 6α- и 6β- изомеров) с количественным выходом.

Для получения аналитически чистого образца использовали метод колоночной хроматографии на SiO₂, предварительно обработанном триэтиламином, используя дихлорметан в качестве элюента.

6α-Изомер (α-VIb), ЯМР ¹Н (400 МГц, CDCl₃, δ, м.д.):7.26-7.22 (м, 2H, H-3,5 (NPh)), 6.72-6.63 (м, 3H, H-2,4,6 (NPh)), 5.73 (с, 1H, H-4), 3.75 (дд, 1H, J = 3.2, 14.4 Гц, NCH₂), 3.14 (дд, 1H, J = 10.5, 14.4 Гц, NCH₂), 2.96 (с, 3H, NCH₃), 2.70 (м, 1H, H-6), 1.18 (с, 3H, 19-CH₃), 0.90 (д, J = 6.5 Гц, 3H, 21-CH₃), 0.87 (д, J = 6.6 Гц, 3H, 26(27)-CH₃), 0.86 (д, J = 6.6 Гц, 3H, 26(27)-CH₃), 0.67 (с, 3H, 18-CH₃).

6β-Изомер (β-VIb), ЯМР ¹Н (400 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 7.26-7.22 (м, 2H, H-3,5 (NPh)), 6.72-6.63 (м, 3H, H-2,4,6 (NPh)), 5.84 (с, 1H, H-4), 3.68 (дд, 1H, J = 10.5, 14.4 Гц, NCH₂), 3.27 (дд, 1H, J = 4.5, 14.4 Гц, NCH₂), 2.99 (с, 3H, NCH₃), 2.88 (м, 1H, H-6), 1.28 (с, 3H, 19-CH₃), 0.92 (д, J = 6.5 Гц, 3H, 21-CH₃), 0.87 (д, J = 6.6 Гц, 3H, 26(27)-CH₃), 0.86 (д, J = 6.6 Гц, 3H, 26(27)-CH₃), 0.76 (с, 3H, 18-CH₃).

Найдено: С 83.49%; Н 10.59%, N 2.81%,

C₃₅H₅₃NO. Вычислено: С 83.44%; Н 10.60%, N 2.78%.

Вариант 2

К суспензии 2,3 ммоль 3,5-диенолэфира (IVa или IVb) в 80 мл абсолютного спирта (метилового или этилового соответственно) добавляли 0,7 мл (0,689 г, 0,675 г в 100% исчислении, 4,7 ммоль) 98% N-метиланилина гидрохлорида и 0,7 мл (0,762 г, 0,282 г в 100% исчислении, 9,4 ммоль) 37% водного раствора формальдегида. Реакционную массу перемешивали при температуре (45±5)°С в течение 30 мин. По окончании реакции реакционную массу выливали медленно при интенсивном перемешивании в 240 мл воды. Осадок отфильтровывали, промывали водой до рН ~ 7 промывной воды, высушили до постоянного веса. Получали соединение VIb (смесь 6α- и 6β-изомеров) с количественным выходом.

Пример 7. Получение 6α-( N -метил- N -фенил)аминометилхолест-4-ен-3-она (α-VIb)

Реакцию изомеризации проводили условиях варианта 2 примера 5. Из 1 г (1,985 ммоль) смеси диастереомеров получали 0,96 г соединения α-VIb с выходом 96%. Т.пл. = 114-117°C.

Пример 8. Получение 6-метиленхолест-4-ен-3-она (I)

Вариант 1

К раствору 2 г (4,528 ммоль) соединения α-VIa, полученного в условиях примера 5 (вариант 2) в 140 мл смеси толуола и ацетона (1:1 по объему) добавили 2 г хлорида аммония и 14 мл 55% H₂SO₄. Реакционную массу перемешивали при температуре (45±5)°С в течение 30-40 мин, затем охладили до комнатной температуры и разбавили 100 мл воды. Водную фазу отделили, экстрагировали толуолом, экстракт объединили с органической фазой. Объединенные органические слои промывали последовательно 55% H₂SO₄, дважды водой, 10% раствором NaОН и водой до рН~7. После этого раствор осушали N₂SO₄, осветляли активированным углем, растворитель упаривали в вакууме, удаляя остатки толуола метанолом. Остаток после упаривания растворили в метаноле, метанольный раствор добавляли медленно при перемешивании в 5-кратное количество воды. Суспензию выдерживали при температуре 8-10°С, осадок отфильтровали. Отфильтрованный и промытый водой осадок сушили в вакууме до постоянного веса. Получали 1,7 г соединения I с выходом 94,65%. Т.пл. 120-122°C (лит. т.пл. 119-121°C [Burn et al. Chem and Ind, 1962, 1908]).

ЯМР ¹Н (400 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 5.90 (уш.с, 1H, H-4), 5.04 (м, 1Н, 6-CH₂), 4.92 (м, 1Н, 6-CH₂), 1.08 (с, 3H, 19-CH₃), 0.92 (д, J = 6.5 Гц, 3H, 21-CH₃), 0.87 (д, J = 6.6 Гц, 3H, 26(27)-CH₃), 0.86 (д, J = 6.6 Гц, 3H, 26(27)-CH₃), 0.70 (с, 3H, 18-CH₃).

ЯМР ¹³C (100.6 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 200.0 (C-3), 169.5 (C-5), 146.4 (C-6), 121.5 (C-4), 113.9 (6-CH₂), 56.1, 56.0, 52.5, 42.4, 40.1, 39.5, 39.1, 36.1, 35.7, 35.6, 35.1, 33.8, 28.1, 28.0, 24.1, 23.8, 22.8, 22.5, 21.0, 18.6, 17.1, 11.9.

Вариант 2

К раствору 4,35 г (8,63 ммоль) соединения VIb (смесь изомеров), полученного в условиях примера 6 (вариант 1) в 300 мл смеси бензола и метилэтилкетона (1:1 по объему) добавили 4,35 г хлорида аммония и 30 мл 55% H₂SO₄. Реакционную массу перемешивали при температуре (45±5)°С в течение 30-40 мин. Затем реакционную массу разбавили 150 мл воды. Водную фазу отделили, экстрагировали бензолом, экстракт объединили с органической фазой. Объединенные органические слои промывали последовательно 55% H₂SO₄, дважды водой, 0.1N раствором КОН и водой до рН~7. Затем раствор осветляли активированным углем, растворитель упаривали в вакууме, удаляя остатки бензола метанолом. Остаток после упаривания растворили в метаноле, метанольный раствор добавляли медленно при перемешивании в 5-кратное количество воды. Суспензию выдерживали при температуре 8-10°С, осадок отфильтровали. Отфильтрованный и промытый водой осадок сушили в вакууме. Получили 3,263 г соединения I с выходом 95,3%. Т.пл. = 120,5-121,5°C.

Б. Схема, вариант 2: II - [III] - [IV] - [VI] - I

Пример 9. Получение 6-метиленхолест-4-ен-3-она (I)

Вариант 1

Ферментативное превращение 1 г (2,586 ммоль) холестерина (II) в холест-4-ен-3-он (III) проводили, как описано в примере 1 варианта схемы 1.

По окончании трансформации реакционную массу разбавляли этилацетатом в соотношении 0,5:1 к объему реакционной массы и выдерживали при интенсивном перемешивании и комнатной температуре (22±2°C) в течение 0,5 часа. Органический слой отделяли. Экстракцию повторяли трижды. Объединенный этилацетатный экстракт промывали водой, сушили над Na₂SO₄. Растворитель упаривали в вакууме до прекращения погона.

К сухому остатку, содержащему холестенон (III), добавляли 5 мл безводного этанола, 2 мл (2,019 г, 13,624 ммоль) триэтилортоформиата, 26 мг (0,15 ммоль) п-ТСК и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин. По окончании реакции получения 3,5-диенолэфира (IVb) к реакционной массе добавили 15 мл безводного этанола и 0,22 г диметиламина гидрохлорида (0,218 г в 100% исчислении, 2,675 ммоль). Затем при перемешивании добавляли 2,1 мл (2,29 г, 0,847 г в 100% исчислении, 28,2 ммоль) 37%-ного водного раствора формальдегида. Реакционную массу перемешивали при температуре (45±5)°С в течение 2 ч. По окончании реакции в реакционную массу добавляли по каплям 10% водный раствор NaOH до рН 7.5-8 при перемешивании и комнатной температуре, разбавили 50 мл бензола. Водную фазу отделили, экстрагировали бензолом. Объединенный экстракт промывали водой до рН ~ 7 промывной воды, сушили над сульфатом натрия. Затем к раствору в бензоле добавили 50 мл ацетона и 1 г хлорида кальция. Реакционную массу перемешивали при температуре (45±5)°С в течение 30-40 мин. Затем реакционную массу разбавили 50 мл воды. Водную фазу отделили, экстрагировали бензолом, экстракт объединили с органической фазой. Объединенные органические слои промывали водой до рН~7. Затем раствор осветляли активированным углем, растворитель упаривали в вакууме, удаляя остатки бензола метанолом. Остаток после упаривания растворили в метаноле, метанольный раствор добавляли медленно при перемешивании в 5-кратное количество воды. Суспензию выдерживали при температуре 8-10°С, осадок отфильтровали. Отфильтрованный и промытый водой осадок сушили в вакууме. Получили 0,906 г соединения I с выходом 88,3% и содержанием основного вещества 95%.

Вариант 2

К сухому остатку, содержащему холестенон (III), полученному в условиях варианта 1, из 3 г (7,759 ммоль) холестерина (II), добавляли 6 мл (5,8 г, 54,7 ммоль) триметилортоформиата и 78 мг (0,45 ммоль) п-ТСК и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин. По окончании реакции получения 3,5-диенолэфира (IVа) к реакционной массе добавили 1,3 мл (1,29 г, 12 ммоль) N-метиланилина и 1,2 мл (1,308 г, 0,484 г в 100% исчислении, 16,12 ммоль) 37% водного раствора формальдегида. Реакционную массу перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч.

По окончании реакции аминометилирования к реакционной суспензии медленно при интенсивном перемешивании добавляли 5% водный раствор аммиака и 150 мл толуола. Реакционную массу перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре, затем водную фазу отделили, экстрагировали толуолом. Объединенный экстракт промывали водой до рН ~ 7 промывной воды, сушили над сульфатом натрия. Затем раствор в толуоле разбавили 150 мл метилэтилкетона и добавили 3 г хлорида аммония и 30 мл 55% H₂SO₄. Реакционную массу перемешивали при температуре (45±5)°С в течение 30-40 мин. Затем реакционную массу разбавили 50 мл воды. Водную фазу отделили, экстрагировали толуолом. Объединенные органические слои промывали водой до рН~7, сушили над N₂SO₄, затем осветляли активированным углем. растворитель упаривали в вакууме, удаляя остатки толуола метанолом. Остаток после упаривания растворили в метаноле, метанольный раствор добавляли медленно при перемешивании в 5-кратное количество воды. Суспензию выдерживали при температуре 8-10°С, осадок отфильтровали. Отфильтрованный и промытый водой осадок сушили в вакууме до постоянного веса. Получили 2,92 г соединения I с выходом 94,9% и содержанием основного вещества ~90%.

Пример 10. Изучение цитотоксической активности 6-метиленхолест-4-ен-3-она формулы I

Темновую и фототоксическую активность 6-метиленхолест-4-ен-3-она (I) оценивали на панели культивируемых линий опухолевых и неопухолевых клеток человека методом МТТ-теста in vitro, описанным в [Niks M., Otto M. Towards an optimized MTT assay. J Immunol Meth. 1990; 130: 1: 149-151; D.V. Andreeva, T.S. Vedekhina, A.S. Gostev, L.G. Dezhenkova, Y.L. Volodina, A.A. Markova, Minh Tuan Nguyen, O.M. Ivanova, V.А. Dolgusheva, A.M. Varizhuk, A.S. Tikhomirov, A.E. Shchekotikhin. European Journal of Medicinal Chemistry. 2024. 268. 116222, doi.org/10.1016/j.ejmech.2024.116222]. В качестве контролей использовали холестерин (II), холест-4-ен-2-он (III), а также 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-дион (эксеместан) - активный ингредиент противоопухолевого препарата «Аромазин», применяемого для лечения гормонозависимого рака молочной железы. Соединения I, II, III и эксеместан растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) до конечной концентрации стокового раствора 20 мМ.

В исследовании использовали следующие клеточные линии человека: НСТ116 (карцинома толстой кишки), MCF7 (эстрогензависимая карцинома молочной железы), MDA-MB-231 (независимая от гормонов карцинома молочной железы), К562 (миелогенный лейкоз), ПФЧ (неопухолевые фибробласты, иммортализованные h-TERT), протестированные в American Type Culture Collection, США.

Клетки НСТ116, MCF7, MDA-MB-231, ПФЧ культивировали в среде DMEM, а клетки К562 - в среде RPMI-1640 с добавлением следующих компонентов до конечных концентраций: 5% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, Южная Америка), 2 mM L-глутамина (ПанЭко, Россия), 100 ЕД/мл пенициллина (ПанЭко, Россия) и 100 мкг/мл стрептомицина (ПанЭко, Россия), инкубация проводилась при 37°С, 5% CO₂ в увлажненной атмосфере. В экспериментах были использованы клетки в логарифмической фазе роста.

ΜТТ-тест для исследования цитотоксичности

Цитотоксическое действие соединений исследовали в МТТ-тесте (по восстановлению желтой соли 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола в темно-синий кристаллический формазан митохондриями живых клеток). По результатам исследования цитотоксичности строили кривые выживаемости и определяли значения концентраций, необходимых для гибели 50% клеток - IC₅₀.

Клетки рассевали в лунки 96-луночного планшета (NUNC, США) (5000 клеток в 190 мкл культуральной среды), инкубировали 24 часа при 37°С, 5% CO₂, в увлажненной атмосфере. Вносили по 10 мкл растворов исследуемых веществ в культуральной среде, приготовленных серийными разведениями из исходного раствора, до 10 конечных концентраций: 0,1-50 мкМ. Интактным контролем в эксперименте служили клетки без препарата, в которые добавляли по 10 мкл клеточной среды. ДМСО как растворитель использовали в нетоксичном диапазоне концентраций (до 0,25% об.), не вызывающем гибель клеток.

Исследование цитотоксичности.

Клетки с препаратами инкубировали 72 ч при 37°С, 5% CO₂, в увлажненной атмосфере. За 1 ч до окончания инкубации в лунки вносили по 20 мкл водного раствора МТТ (5 мг/мл, ПанЭко, Россия) и инкубировали при 37°С, 5% CO₂, в увлажненной атмосфере 1,5 ч. После окончания инкубации культуральную среду отбирали, клетки ресуспендировали в 100 мкл ДМСО и измеряли оптическую плотность раствора на планшетном спектрофотометре Multiscan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны 570 нм. Процент клеток, выживших при действии каждой дозы соединения, подсчитывали как частное от деления средней оптической плотности в лунках после инкубации с данной дозой к средней оптической плотности контрольных лунок (значения последних приняты за 100%). Каждая экспериментальная точка выполнялась в трёх повторах.

По результатам исследования были определены показатели IC₅₀. Максимальная цитотоксичность 6-метиленхолестенона (I), существенно превышающая цитотоксическое действие эксеместана, была выявлена в концентрациях 23.24 мкМ и 20.29 мкМ на клетках K562 (миелогенный лейкоз) и MCF7 (эстрогензависимая карцинома молочной железы) соответственно, а также на клетках MDA-MB-231 (независимая от гормонов карцинома молочной железы). Результаты исследования представлены в таблице 1.

Таблица 1. Определение цитотоксичности 6-метиленхолест-4-ен-3-она (IC₅₀) в отношении опухолевых и неопухолевых клеток человека in vitro

Соединение K562 MDA-MB-231 MCF7 HCT116 ПФЧ Холестерин (II) >50 >50 >50 >50 >50 Холестенон (III) >50 23,93 34,27 22,60 25,85 6-метиленхолестенон (I) 23,24 32,01 20,29 >50 >50 Эксеместан 28,52 >50 31,69 48,22 >50

Таким образом, 6-метиленхолест-4-ен-3-он (I) обладает избирательной цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток человека, в частности, в отношении карциномы молочной железы как эстрогензависимой, так и независимой от гормонов. Поэтому 6-метиленхолест-4-ен-3-он (I) можно рассматривать как перспективное соединение для дальнейшего углубленного изучения его противоопухолевой активности с целью создания новых лекарственных средств для медицинского применения, в частности для терапии онкологических заболеваний.

Изобретение относится к области биотехнологии, органической химии и фармацевтики, конкретно к улучшенному способу получения 6-метиленхолест-4-ен-3-она формулы I, обладающего цитостатической активностью. Способ включает энзиматическое селективное окисление холестерина II с образованием холест-4-ен-3-она III, его енолэтерификацию с образованием 3-алкоксихолеста-3,5-диен-3-она IV, конденсацию IV с реагентом Манниха, образующимся in situ из формальдегида и вторичного амина с образованием N,N-дизамещенного производного 6-аминометилхолест-4-ен-3-она VI и дезаминирования соединения VI с образованием 6-метиленовой группы и получением целевого продукта. Стадии синтеза осуществляют без выделения интермедиатов. Техническим результатом изобретения является предоставление простого и эффективного способа получения целевого соединения из холестерина с общим выходом не менее 84%. 14 з.п. ф-лы, 1 табл., 10 пр.

1. Способ получения 6-метиленхолест-4-ен-3-она формулы I, обладающего цитостатической активностью,

из холестерина формулы II,

последовательностью превращений, включающей энзиматическое окисление 3β-гидроксильной группы кольца А молекулы холестерина, сопровождаемое изомеризацией Δ⁵-связи в Δ⁴-связь с образованием холест-4-ен-3-она формулы III;

енолэтерификацию Δ⁴-3-кетосистемы полученного соединения действием триалкилортоформиата в присутствии кислого катализатора с образованием 3-алкоксиэфира Δ^3,5-3-гидроксипроизводного общей формулы IV;

где R₂=CH₃ или CH₂CH₃,

конденсацию его с реагентом Манниха, образующимся in situ из формальдегида и вторичного амина общей формулы V,

где R=СН₃ или Ph,

в присутствии кислого катализатора, или формальдегида и соли вторичного амина общей формулы V, с образованием стероидного основания Манниха общей формулы VI

где R=СН₃ или Ph,

региоселективное расщепление полученного стероидного основания Манниха по связи C-N действием минеральной кислоты в присутствии соли галогенводородной кислоты и щелочного или щелочноземельного металла или аммония;

при этом стадии окисления холестерина (II) с образованием холестенона (III), его енолэтерификации с образованием 3-алкокси-3,5-диен-производного общей формулы (IV), трехкомпонентной конденсации с реагентом Манниха с образованием N,N-дизамещенных производных 6-аминометилхолест-4-ен-3-она общей формулы VI проводят без выделения интермедиатов, полученные N,N-дизамещенные производные 6-аминометилхолест-4-ен-3-она общей формулы VI представляют собой или смесь 6α- и 6β-диастереомеров, или индивидуальные 6α-диастереомеры.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что энзиматическое окисление 3β-гидроксильной группы кольца А молекулы холестерина (II) с образованием холест-4-ен-3-она формулы III проводят с использованием в качестве катализатора рекомбинантной холестериноксидазы бактерий Nocardioides simplex, взятой в количестве, необходимом для полного превращения исходного соединения II.

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что енолизацию Δ⁴-3-кетосистемы соединения III для этерификации с образованием 3-алкоксиэфира Δ^3,5-3-гидроксипроизводного общей формулы IV проводят в присутствии протонных кислот в качестве кислого катализатора енолизации.

4. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что в качестве протонных кислот используют минеральные или органические кислоты.

5. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что в качестве органических кислот для енолизации Δ⁴-3-кетосистемы соединения III используют сульфокислоту, выбранную из группы, включающей сульфосалициловую кислоту, п-толуолсульфокислоту.

6. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что образование 3-алкоксиэфира Δ^3,5-3-гидроксипроизводного общей формулы IV может быть проведено в среде протонного или апротонного растворителя, в качестве которого используют алифатические спирты, циклические эфиры, ароматические углеводороды ряда бензола или их смеси.

7. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что в качестве алифатических спиртов используют спирты, выбранные из группы, включающей метанол, этанол.

8. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что в качестве циклических эфиров используют эфиры, выбранные из группы, включающей диоксан, тетрагидрофуран.

9. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что в качестве ароматических углеводородов ряда бензола используют ароматические углеводороды, выбранные из группы, включающей бензол, толуол.

10. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве триалкилортоформиата используют триметилортоформиат или триэтилортоформиат.

11. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что конденсацию соединения общей формулы IV с реагентом, полученным из формальдегида и вторичного амина общей формулы V, проводят в присутствии кислого катализатора.

12. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что конденсацию соединения общей формулы IV проводят с реагентом, полученным из формальдегида и соли вторичного амина общей формулы V, без кислого катализатора.

13. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что дезаминирование диастереомерной смеси соединений общей формулы VI проводят в среде апротонного растворителя или смеси апротонных растворителей действием разбавленной серной кислоты.

14. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве солей галогеноводородной кислоты могут быть использованы соли щелочных или щелочноземельных металлов или аммония, а в качестве галогенводородной кислоты могут быть использованы хлористоводородная или бромистоводородная кислоты.

15. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что дезаминирование смеси соединений общей формулы VI проводят без их выделения из реакционной массы.