N-ЗАМЕЩЕННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ 6α-ПИПЕРАЗИНОМЕТИЛАНДРОСТ-4-ЕН-3,17-ДИОНА, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2023 года по МПК C07J43/00 A61K31/58 A61P31/10 A61P31/12 

Область техники

Настоящее изобретение относится к новым стероидным соединениям ряда андростана, таким как N-замещенные производные 6α-пиперазинометиландрост-4-ен-3,17-диона общей формулы I

где R = СН₃, или Ph, или CH₂Ph,

обладающим антимикробной активностью, которые могут быть использованы в качестве активных ингредиентов в лекарственных средствах для медицинского применения, в частности для терапии инфекционных заболеваний, и способу получения соединений формулы I, который может найти применение в химической и фармацевтической промышленности.

Уровень техники

В настоящее время во всем мире широкое применение находят лекарственные средства стероидной природы. В последние годы возник интерес к стероидным основаниям Манниха как потенциальным лекарственным средствам. Они способны реверсивно превращаться в организме под воздействием внешних факторов (среда, рН, температурный режим) в родительское лекарственное вещество или его метилен-производное. При этом обнаружено, что основания Манниха как стероидной, так и нестероидной природы, способны проявлять не только физиологическую активность, свойственную родительскому соединению или его метиленовому производному, но и способны обладать новым биологическим действием. Детально изучено лишь одно стероидное основание Манниха ряда прегнана - 17α-ацетокси-6-диметиламинометил-21-фтор-3-этоксипрегна-3,5-диен-20-он. У этого соединения обнаружено сильное анальгезирующее действие, связанное, по мнению авторов, с наличием третичного атома азота. Соединение является селективным агонистом μ-опиоидных рецепторов с хорошим потенциалом, так как, в отличие от морфина, оно не только проявляет сильное антиноцицепторное (анальгетическое) действие, но в высоких дозах не оказывает негативного влияния на двигательную активность [The steroid 17α-acetoxy-6-dimethylaminomethyl-21-fluoro-3-ethoxy-pregna-3,5-dien-20-one (SCI7599) is a selective μ-opioid agonist, I.J. McFadyen, G.H. Woods, H. Houshyar //Mol. Pharmacol. 2000, 58(4), P 669-676. Antinociceptive and other behavioral effects of the SC17599 are medicated by μ-opioid receptor, H. Houshyar, I.J. McFadyen, G.H. Woods, G.R. Traynor //European J. Pharmacol., 2000, 39512), P 121-128].

С⁶-Аминометилпроизводные Δ⁴-3-кетостероидов являются новыми интересными объектами для изучения их биологической активности.

Некоторые представители этой группы соединений ранее применялись исключительно как промежуточные соединения в синтезе 6-метилен- или 6-метилстероидов. Так, С⁶-аминометилпроизводные Δ⁴-3,17-дикетостероиды служили промежуточными соединениями в синтезе 6-метилен-Δ^1,4-3,17-дикетоандростанов, например, эксеместана (CAS №107868-30-4) - антиэстрогена, обладающего противораковой активностью.

Известны способы С⁶-аминометилирования Δ⁴-3-кетостероидов рядов прегнана и андростана реакцией Манниха [GB 1280569, 1972; GB 1280570, 1972: US 4990635, 1991; CN 1415624, 2003; CN 1491957, 2004; RU 2425052, 2011; RU 2663483, 2018]. Введение С⁶-аминометильной группы в Δ⁴-3-кетостероиды трехкомпонентной конденсацией (по типу реакции Манниха) осуществляют, используя формальдегид в качестве метиленирующего агента. При этом предусматривается обязательная предварительная енолизация Δ⁴-3-кетосистемы кольца А, необходимая для поляризации системы двойных связей с образованием нуклеофильного атома углерода С⁶, для обеспечения региоселективности аминометилирования по атому С⁶ с целью исключения побочной реакции по атому С² в α-положении к 3-кетогруппе. Промежуточный 3,5-диенол выделяют в виде эфира или проводят енолизацию in situ без выделения енолизованного интермедиата [US 4990635, 1991; RU 2663483, 2018].

Получение метилового 3,5-диенолэфира андрост-4-ен-3,17-диона (андростендиона, II) описано в патентах [RU 2163606, 2001 (пример 1) и RU 2425052, 2011 (пример 1)] и заключается в реакции соединения II с триметилортоформиатом в среде метанола в присутствии сульфосалициловой кислоты (ССК) при комнатной температуре. По окончании реакции в реакционную массу добавляют ацетон для регенерации 17-кетогруппы и затем триэтиламин до рН 7-8 для нейтрализации ССК. Целевой продукт высаживают добавлением воды.

Известен способ синтеза 6-метиленпроизводных андроста-1,4-диен-3,17-диона [US 4990635, 1991, пример 1] через образование С⁶-аминометильного интермедиата из андростендиона или его производного. Согласно этому способу андростендион в среде тетрагидрофурана и этанола обрабатывают триэтилортоформиатом в присутствии п-толуолсульфокислоты (п-ТСК) как катализатора при температуре 40°С. Затем к образовавшемуся 3-этоксиандроста-3,5-диен-17-ону без выделения добавляют дополнительное количество п-ТСК, вторичный амин (N-метиланилин) и 40% водный раствор формальдегида. Реакционную массу выдерживают при 40°С в течение 2 ч и по окончании реакции аминометилирования обрабатывают концентрированной соляной кислотой. Аналогичный способ получения 6-(N-метил-N-фенил)аминометилпроизводного андростендиона из соединения II в синтезе 6-метилен-андростендиона из соединения II использован в патентах [CN 1415624, 2003 и CN 1491957, 2004]. Таким образом, 6-(N-метил-N-фенил)аминометилпроизводное андростендиона, образование которого происходит в результате трехкомпонентной конденсации по типу реакции Манниха, используется только в качестве интермедиата синтеза 6-метилен-андростендиона in situ.

В патенте US 4990635 (1991) есть упоминание о том, что в качестве реагента в реакции конденсации может быть использована соль вторичного амина (N-метиланилина или N-этиланилина) с неорганической (в частности с хлористоводородной) или органической (в частности п-ТСК) кислотой в количестве 1-2 эквивалентов, однако это заявление не подтверждено примерами.

Наиболее близким по сущности к заявленному способу получения N-замещенных производных 6α-пиперазинометиландрост-4-ен-3,17-диона общей формулы I является способ получения 6-аминометилстероидных соединений, конкретно 3-кето-Δ⁴-6β-(N-дизамещенных)аминометилпроизводных стероидов, имеющих в кольце А Δ⁴-3-кето-структуру, а в кольце В при атоме С⁶ группу CH₂N(R¹)(R²), в которой заместители R¹ и R^{2 имеют различную структуру или R1, R2 и атом N вместе взятые образуют вторичную циклическую алкиленимино-группу, содержащую от пяти до семи членов [GB 1280569, 1972]. Способ заключается в смешении вторичного амина, формальдегида, сильной кислоты и С6-незамещеного стероидного соединения, имеющего в кольцах А и В структуру простого С3-Δ3,5-стероидного эфира. При этом в качестве циклического вторичного амина используют незамещенные или замещенные пиперидины или пирролидины. Данных о применении пиперазина и/или его N4-замещенных в патенте не имеется [GB 1280569, 1972].}

Согласно описанию известного способа [GB 1280569, 1972 (пример 1)], к раствору 3 г 17-ацетата 17α-гидрокси-3-метокси-3,5-прегнадиен-20-она в 30 мл тетрагидрофурана добавляют 1,5 мл пиперидина, 0,5 мл 37% формалина, и 1,5 г п-ТСК; раствор кипятят на паровой бане в течение 3 часов, добавляя 37% формалин и пиперидин в процессе кипячения до достижения суммарного количества реагентов 2 мл и 3 мл соответственно; затем тетрагидрофуран отгоняют, остаток экстрагируют бензолом; бензольный раствор экстрагируют водой и 0,2N раствором серной кислоты; кислую фазу нейтрализуют разбавленным раствором карбоната натрия и затем экстрагируют хлористым метиленом; раствор в хлористом метилене промывают раствором разбавленной соляной кислоты, раствором карбоната натрия, сушат, растворитель отгоняют и получают с высоким выходом 17-ацетат 6β-пиперидинометил-17α-гидрокси-4-прегнен-3,20-диона. Аналогично получают другие 3-кето-Δ⁴-6β-(N-дизамещенные)аминометилпроизводные стероидов, используя замещенные пиперидины и другие вторичные циклические амины.

Однако выходы полученных 3-кето-Δ⁴-6β-(N-дизамещенных)аминометил-производных стероидов не указаны. В описании патента отсутствуют примеры получения соединений формулы I предложенным способом и нет никаких указаний на возможность их получения [GB 1280569, 1972]. Таким образом, заявленные N-замещенные 6α-пиперазинометил-Δ⁴-3,17-дикетостероиды, точнее N-замещенные производные 6α-пиперазинометиландрост-4-ен-3,17-диона общей формулы I, а именно 6α-[(4-метил-1-пиперазинил)метил]андрост-4-ен-3,17-дион (Ia), 6α-[(4-фенил-1-пиперазинил)метил]андрост-4-ен-3,17-дион (Ib) и 6α-[(4-бензил-1-пиперазинил)метил]андрост-4-ен-3,17-дион (Ic), являются новыми соединениями, в доступных литературных источниках не описаны.

Способ получения N-замещенных производных 6α-пиперазинометиландрост-4-ен-3,17-диона общей формулы I из андрост-4-ен-3,17-диона (II) также не описан.

Раскрытие сущности изобретения

Задачей заявленной группы изобретений является получение новых стероидных соединений ряда андростана, конкретно N-замещенных производных 6α-пиперазинометиландрост-4-ен-3,17-диона, обладающих антимикробной активностью, и разработка эффективного способа их получения из андрост-4-ен-3,17-диона (II).

Задача решается полученными новыми N-замещенными производными 6α-пиперазинометиландрост-4-ен-3,17-диона общей формулы I,

где R = СН₃, или Ph, или CH₂Ph,

обладающими антимикробной активностью, а также способом получения новых соединений общей формулы I из андрост-4-ен-3,17-диона (II),

включающим взаимодействие соединения II с триметилортоформиатом в присутствии кислотного катализатора с образованием 3-метоксиандроста-3,5-диен-17-она (III),

и последующую конденсацию соединения III с реагентом, образующимся in situ из формальдегида и гидрохлорида N-замещенного пиперазина общей формулы IV,

где R = СН₃, Ph, CH₂Ph.

Получаемые соединения общей формулы I представляют собой индивидуальные 6α-диастереомеры.

При взаимодействии соединения II с триметилортоформиатом в среде безводного апротонного растворителя, такого как циклические эфиры, например 1,4-диоксан, происходит енолэтерификация Δ⁴-3-кетосистемы соединения II с образованием соединения III. Сначала проводят енолизацию указанной Δ⁴-3-кетосистемы действием хлористого водорода, растворенного в безводном апротонном растворителе, в качестве которого используют циклические эфиры, например 1,4-диоксан. Конденсацию соединения III с реагентом Манниха, образующимся in situ из формальдегида и гидрохлорида N-замещенного пиперазина IV, проводят в среде протонного растворителя, в качестве которого используют алифатический спирт, например метанол.

Технический результат - эффективный способ получения новых N-замещенных производных 6α-пиперазинометиландрост-4-ен-3,17-диона общей формулы I в виде индивидуальных 6α-диастереомеров.

Ниже представлена предлагаемая общая схема способа синтеза новых соединений общей формулы I из андрост-4-ен-3,17-диона (II) (Схема 1).

где R = СН₃, или Ph, или CH₂Ph

Схема синтеза включает: (а) енолизацию α,β-ненасыщенного кетона в положении 3 соединения II и этерификацию с образованием соединения III; (б) реакцию трехкомпонентной конденсации соединения III с реагентом, образующимся in situ из формальдегида и гидрохлорида N-замещенного пиперазина IV, которая приводит к образованию N-замещенных производных 6α-пиперазинометиландрост-4-ен-3,17-диона общей формулы I.

Способ осуществляют в мягких условиях на стандартном оборудовании с использованием коммерчески доступных реагентов.

Оказалось, что стадия (б) заявляемого способа стереоселективна и соединения формулы I, получаемые этим способом представляют собой индивидуальные 6α-диастереомеры, что подтверждено данными ЯМР-спектроскопии. Такой результат нельзя было ожидать на основании информации, известной из уровня техники. Известно, что реакция Манниха в жестко сочлененных полициклических структурах, к которым относятся стероиды, нестереоселективна и протекает с образованием смеси 6 а- и 6р-диастереомеров [RU 2425052, 2011; RU 2663483, 2018].

Преимущество заявляемого способа состоит в том, что он позволяет получать индивидуальные 6α-диастереомеры соединений общей формулы I. Стереоселективность трехкомпонентной конденсации по типу реакции Манниха имеет место при проведении реакции в предлагаемых условиях. Получение индивидуальных 6α-диастереомеров непосредственно в результате синтеза устраняет необходимость применения трудоемкой и неэффективной операции разделения диастереомеров или проведения реакции инверсии аксиального 6β-диастереомера в экваториальный 6α-изомер способами, известными из уровня техники.

Заявленный способ получения соединений общей формулы I осуществляют следующим образом. Андрост-4-ен-3,17-дион (II) подвергают енолэтерификации Δ⁴-3-кетосистемы кольца А действием триметилортоформиата в присутствии минимального количества 4М раствора хлористого водорода в 1,4-диоксане, необходимого для енолизации Δ⁴-3-кетогруппы. Затем полученное соединение III подвергают конденсации с реагентом, образующимся in situ из формальдегида и гидрохлорида N-замещенного пиперазина общей формулы IV, с образованием N-замещенного производного 6α-пиперазинометиландрост-4-ен-3,17-диона общей формулы I.

Общий выход 6α-[(4-метил-1-пиперазинил)метил]андрост-4-ен-3,17-диона (Ia), получаемого из андростендиона II, составляет не менее 90%.

Общий выход 6α-[(4-фенил-1-пиперазинил)метил]андрост-4-ен-3,17-диона (Ib), получаемого из андростендиона II, составляет не менее 90%.

Общий выход 6α-[(4-бензил-1-пиперазинил)метил]андрост-4-ен-3,17-диона (Ic), получаемого из андростендиона II, составляет не менее 90%.

Известно [US 4990635, 1991], что вместо триметилортоформиата в этом процессе может быть использован триэтилортоформиат, а в качестве апротонного растворителя при осуществлении способа получения заявленных соединений I могут быть использованы любые протонные и апротонные (неполярные, малополярные и полярные) растворители, пригодные для проведения реакции и инертные по отношению к реактантам, такие как алифатические спирты (например метанол, этанол), циклические простые эфиры (например 1,4-диоксан, тетрагидрофуран) и другие, известные из уровня техники, обеспечивающие полноту проведения реакции.

Получение заявленных соединений Ia-с из андрост-4-ен-3,17-диона (П) иллюстрируется схемой 2, представленной ниже.

Для повышения нуклеофильности атома С⁶ и тем самым уменьшения вероятности протекания побочных процессов конденсации по другим реакционным центрам (например, по атому С²) на первом этапе синтеза проводится реакция енолизации Δ⁴-3-кетосистемы кольца А соединения II с образованием 3,5-диенолэфира формулы III. Реакцию енолэтерификации Δ⁴-3-кетосистемы кольца А с выделением енолэфира III проводят действием триалкилортоэфира муравьиной кислоты (например триметилортоформиата) с использованием минимального количества триалкилортоформиата, необходимого для обеспечения протекания реакции (не менее 1 моля на 1 моль стероида). Для более полного и быстрого протекания реакции (15-30 мин, но не более 4 ч) используется избыток алкилортоформиата (от 3 до 9 моль на 1 моль стероида). Однако это условие не является обязательным. Реакция проводится в безводных условиях в апротонном растворителе, выбранном из группы циклических эфиров (например 1,4-диоксан).

В качестве катализатора енолизации применен солянокислый диоксан, а именно 4М раствор хлористого водорода в 1,4-диоксане, однако могут быть использованы любые протонные кислоты, обеспечивающие енолизацию Δ⁴-3-кетосистемы кольца А соединения II с образованием 3,5-диенола, известные из уровня техники специалисту.

В синтезе соединений общей формулы I из соединения III введение заместителя в положение С⁶ осуществляют трехкомпонентной конденсацией по типу реакции Манниха с применением реагента, образованного in situ взаимодействием формальдегида и иминиевой соли - гидрохлорида соединения общей формулы IV. При этом стадия получения иминиевой соли соединений общей формулы IV может быть проведена как с высушиванием соли до постоянного веса и использованием ее по мере надобности, так и без предварительной наработки. Предпочтительно этапы получения иминиевой соли и ее использования в реакции Манниха проводить без высушивания гидрохлоридов N⁴-замещенных пиперазина общей формулы IV в связи с их высокой гигроскопичностью.

Реакция аминометилирования может быть проведена в среде, содержащей циклический эфир (например 1,4-диоксан или тетрагидрофуран), или ароматический углеводород группы бензола (например бензол или толуол), или алифатический спирт (например метиловый или этиловый). Предпочтительно использовать метиловый спирт, в котором иминиевая соль хорошо растворима. В раствор соединения I в метаноле добавляют водный раствор аммиака для нейтрализации соляной кислоты и высаживания целевого продукта реакции. Осадок сушат в вакууме до постоянного веса. Получают целевой продукт в виде аморфного белого с желтоватым оттенком или желтого порошка. При этом достигается количественный выход N-замещенных производных 6α-пиперазинометиландрост-4-ен-3,17-диона (I), считая на 3-метоксиандроста-3,5-диен-17-дион (III).

Образование индивидуальных ба-диастереомеров стероидных оснований Манниха в результате реакции трехкомпонентной конденсации подтверждено данными спектров ЯМР ¹Н, в частности, анализом спектров NOESY. Получают N-замещенные производные 6α-пиперазинометиландрост-4-ен-3,17-диона общей формулы I с содержанием основного вещества не менее 90%, которые могут быть использованы в химическом процессе дезаминирования с образованием 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона без дополнительной очистки.

Антимикробную активность полученных новых соединений общей формулы I оценивали в сравнении с андростендионом II и индикаторными антибиотиками. Антибактериальную активность тестировали в отношении штаммов условно-патогенных бактерий Staphylococcus aureus FDA 209Р, Bacillus subtilis ATCC 6633 и Escherichia coli ATCC 25922 диск-диффузионным методом [EUCAST Disk Diffusion Method for Antimicrobial Susceptibility Testing Version 10.0 (January 2022). https://wwvv.eucast.org/; B. Kowalska-Krochmal, and R. Dudek-Wiener. The Minimum Inhibitory Concentration of Antibiotics: Methods, Interpretation, Clinical Relevance. Pathogens. 2021. 10. 165. https://doi.org/10.3390/pathoaens 100201651, а противогрибковую активность - в отношении Aspergillus niger INA 00760. Все тест-культуры были получены из коллекции культур ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе».

В качестве контроля для определения чувствительности микроорганизмов к тестируемым соединениям in vitro использовали индикаторные диски с амфотерицином В (40 мкг), нистатином (80 мкг), амоксиклавом (амоксициллин 20 мкг + клавулановая кислота 10 мкг).

Заявляемые соединения обладают неспецифической антибактериальной активностью в отношении бактериального штамма Staphylococcus aureus FDA 209Р. В отличие от андростендиона, заявленные соединения обладают умеренной противогрибковой активностью в отношении штамма Aspergillus niger INA 00760.

Полученные по настоящему изобретению ранее неизвестные N-замещенные производные 6α-пиперазинометиландрост-4-ен-3,17-диона общей формулы I, обладающие антимикробной активностью, могут найти применение в качестве активных ингредиентов лекарственных средств для медицинского применения, например, лекарственных средств с андрогенной или иной активностью, присущей молекулам андрост-4-ен-3,17-диона или его 6-метилен-аналога, а также могут быть использованы как исходные субстраты для дальнейшего превращения в 6-метиленандрост-4-ен-3,17-дион, который является предшественником в синтезе эксеместана.

Заявленное изобретение иллюстрируется представленными ниже примерами. Продолжительность реакций указана для иллюстрации. Результаты тестирования антибактериальной активности на штаммах Staphylococcus aureus FDA 209Р, Bacillus subtilis ATCC 6633 и Escherichia coli ATCC 25922, а также противогрибковой активности на штамме Aspergillus niger INA 00760 приведены для иллюстрации наличия антимикробной активности.

Осуществление изобретения

Андростендион (II) (CAS 63-05-8, С₁₉Н₂₆О₂, M.W. 286.41) является коммерчески доступным и может быть приобретен, например, у компании Steraloids Inc. (USA). Триметилортоформиат (≥99.0%), триэтиламин (≥99.0%), 4М раствор HCl в 1,4-диоксане (солянокислый диоксан), а также другие реагенты и растворители являются коммерчески доступными, могут быть приобретены, например, у компании Sigma-Aldrich Со.

Для выделения продуктов по окончании реакций разбавлением реакционных масс водой, а также для промывки осадков, экстрактов в органических растворителях использовали питьевую водопроводную воду, если не оговорено особо. Для приготовления водных растворов аммиака и триэтиламина использовали дистиллированную воду.

Все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли на стандартном стеклянном оборудовании при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 20 до 25°С. Для процессов, требующих более низкие температуры, охлаждение обеспечивали смесью колотого льда и холодной воды (в диапазоне от 5 до 10°С), или смесью колотого льда и хлорида кальция (при температуре ниже 5°С), или жидкого азота (при температуре ниже минус 20°С).

Удаление растворителей в вакууме осуществляли с использованием ротационного вакуумного испарителя Rotavapor® R-300 (BUchi Labortechnik AG), при остаточном давлении 0,35±0,05 кгс/см² (35±5 кПа) и температуре воды в бане от 35 до 50°С в зависимости от природы упариваемого растворителя. Центрифугирование суспензий осуществляли на центрифуге СМ-50М Micro Centrifuge со скоростью 1200 об./мин.

Высушивание целевых продуктов до постоянного веса осуществляли в вакуум-сушильном шкафу при температуре до 40°С и остаточном давлении 0,1±0,05 кгс/см² (10±2 кПа), или в вакуум-эксикаторе с NaOH в качестве поглотителя влаги при комнатной температуре.

Для определения рН промывных вод использовали универсальную индикаторную бумагу с диапазоном значений от 0 до 12 (Лахема, Чешская Республика).

Безводные растворители (1,4-диоксан, триэтиламин, метанол, гексан) получали общеизвестными методами органической химии.

Контроль за ходом реакций осуществляли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), используя пластины TLC-Plattern Kieselgel 60F254 (Merck, Germany) с детекцией светом с длиной волны 254 нм (λ=254 нм) в УФ диапазоне. В качестве элюентов использовали следующие системы растворителей: (А) - дихлорметан/этилацетат (10:1 об./об.), (В) - дихлорметан/этилацетат/метанол (10:1:1 об./об./об.) с добавлением 0,05 мл 25% водного раствора аммиака.

Заявляемые соединения представляют собой кристаллические вещества белого с желтоватым оттенком или желтого цвета, хорошо растворимые в хлористом метилене, хлороформе, 1,4-диоксане, тетрагидрофуране, метаноле, этаноле, ацетонитриле, диметилсульфоксиде (ДМСО), в водных растворах минеральных (например соляной, серной и др.) и органических кислот (например ССК, п-ТСК и др.), содержащихся в эквимолярном количестве.

Для подтверждения структуры и чистоты выделенных соединений использовали следующие методы: ТСХ (пластины TLC-Plattern Kieselgel 60F254 (Merck, Germany)), высокоэффективную жидкостную хроматомасс-спектрометрию (ВЭЖХ/МС), спектроскопию ЯМР.

¹Н- и ¹³С- ЯМР спектры регистрировали на спектрометрах фирмы Bruker Avance™ 600 (рабочая частота 600.22 МГц и 150.925 МГц для ¹Н и ¹³С соответственно) и Bruker Avance™ 500 (рабочая частота 500.13 МГц и 125.77 МГц для ¹Н и ¹³С соответственно), (Bruker BioSpin GmbH), используя в качестве растворителя дейтерированный хлороформ (99,8% D, Sigma-Aldrich). Химические сдвиги в спектрах ЯМР ¹H определены в миллионных долях (м.д.) относительно остаточного сигнала CHCl₃ в CDCl₃ (7.28 м.д.), в спектрах ЯМР ¹³С - относительно сигнала CDCl₃ (77.04 м.д.). Отнесение сигналов в спектрах ЯМР ¹Н и ¹³С было сделано на основе одномерных спектров ЯМР¹³С, записанных в режиме JMODECHO, а также двумерных спектров COSY (¹Н,¹Н), HMQC (¹Н,¹³С), HSQC (¹Н,¹³С), НМВС (¹Н,¹³С) и NOESY (¹H,¹H).

ВЭЖХ/МС проводили на хроматографе Agilent (Agilent Tech. Inc., USA), используя колонку Onyx C18 (50×3 mm). Градиент подвижной фазы: 2.5-100% раствор ацетонитрила в воде, содержащий 0.1% трифторуксусной кислоты. Скорость потока 0.6 мл/мин., время разделения 3 мин.

Пример 1. Получение 3-метоксиандроста-3.5-диен-17-она (III)

К раствору 6,5 г (22,69 ммоль) андрост-4-ен-3,17-диона (II) в 40 мл безводного 1,4-диоксана добавляли 8 мл (7,741 г, 72,94 ммоль) триметилортоформиата. Реакционную массу перемешивали в течение 15 мин при температуре 30°С. Затем добавляли порциями 0,6 мл 4М раствора хлористого водорода в 1,4-диоксане в течение 1 мин. Реакционную массу выдерживали при перемешивании в течение 4 ч при температуре 30°С. Окончание реакции определяли с помощью ТСХ в системе А. По окончании реакции к реакционной массе добавляли 10% водный раствор триэтиламина до рН 8-9, разбавляли 100 мл воды. Осадок отфильтровывали, промывали на фильтре раствором 0,15 мл 25% водного раствора аммиака в 50 мл метанола, охлажденным до температуры 5°С. Осадок сушили в вакууме до постоянного веса. Получали 6,254 г (20,816 ммоль) соединения III в виде белых кристаллов с выходом 91,74%. Т.пл. 171-172°С.

ВЭЖХ/МС (С₂₀Н₂₈О₂) М: вычислено 300.4; найдено: 301.2 [М+Н]⁺.

ЯМР ¹Н (500.13 МГц, CDCl₃, δ): 5.26 (уш.м., 1Н, СН-6), 5.15 (уш.м, 1Н, СН-4), 3.59 (с, 3Н, ОСН₃), 1.10 -2.50 (м, 17Н, СН₂- 1, 2, 7, 11, 12, 15, 16 -; СН- 8, 9, 14), 1.01 (с, 3Н, СН₃-19), 0.92 (с, 3Н, CH₃-18).

ЯМР ¹³С (125.77 МГц, CDCl₃, δ): 221.12 (СО-17), 155.48 (С-3), 141.02 (С-5),. 117.42 (СН-6), 98.39 (СН-4), 54.30 (CH₃O-3), 51.90 (СН-14), 48.43 (СН-9), 47.70 (С-13), 35.88 (СН₂-16), 35.32 (С-10), 33.76 (СН₂-1), 31.53 (СН-8), 31.47 (СН₂-12), 30.74 (СН₂-7), 25.27 (СН₂-2), 21.85 (СН₂-15), 20.51 (СН₂-11), 18.93 (СН₃-19), 13.69 (СН₃-18).

Пример 2. Получение 6α-[(4-метил-1-пиперазинил)метил]-андрост-4-ен-3,17-диона (Ia, R = CH₃)

К раствору 0,4 мл (361 мг, 3,6 ммоль) 1-метилпиперазина (IV, R = СН₃) в 0,6 мл безводного 1,4-диоксана добавляли 1 мл 4М раствора HCl в 1,4-диоксане и после перемешивания в течение 1-5 мин добавляли 1 мл гексана для обеспечения полноты высаживания. Выпавший осадок отделяли центрифугированием при 1200 об/мин при комнатной температуре. Осадок промывали гексаном дважды по 1 мл, затем растворяли в 3 мл метанола. Полученный раствор добавляли при перемешивании к суспензии 500 мг (1,66 ммоль) III в 3 мл метанола, затем добавили 3 мл 37%-ного водного раствора формальдегида. Реакционную массу перемешивали в течение 2 ч при температуре 40°С до растворения суспензии и выдерживали в течение 12 ч при комнатной температуре. Окончание реакции определяли с помощью ТСХ в системе В. По окончании реакции в реакционную массу добавляли раствор 0,2 мл 25% водного раствора аммиака в 20 мл воды и перемешивали в течение 5 минут при комнатной температуре. Наблюдали образование маслянистого осадка. Водный слой декантировали, осадок промывали дважды порциями по 5 мл воды при перемешивании в течение 5 минут и сушили в вакууме до постоянного веса. Получали соединение 1а в виде белого с желтоватым оттенком порошка с количественным выходом, содержащего по данным ЯМР-спектроскопии 6α-диастереомер.

ВЭЖХ/МС (C₂₅H₃₈N₂O₂) М: вычислено 398.6; найдено: 399.3 [М+Н]⁺.

ЯМР ¹Н (600.22 МГц, CDCl₃, δ): 5.76 (с, 1Н, СН-4), 2.67 (м, 1Н, СН-6), 1.3-2.50 - (м, 26 Н, СН₂- 1, 2, 7, 11, 12, 15, 16, 1а, 2а, 3а; СН - 8, 14). 2.29 (с, 3Н, СН₃-4а), 1.00 (м, 1Н СН-9), 1.22 (с, 3Н, СН₃-19), 0.94 (с, 3Н, СН₃-18).

ЯМР ¹³С (150.925 МГц, CDCl₃, δ): 220.47 (СО-17), 199.51 (СО-3), 171.44 (С-5), 126.67 (СН-4), 53.41 (СН-9), 50.97 (СН-14), 47.53 (С-13), 45.9 (СН₃-4а), 41.32 (СН-6), 38.33 (С-10), 30.50 (СН-8), 20.25, 21.83, 31.27, 32.70, 34.01, 35.74, 37.59, 53.44, 55.15, 63.08 (СН₂ -1,2,7, 11, 12, 15, 16, 1а, 2а, 3а), 19.52 (СН₃-19), 13.83 (СН₃-18).

Пример 3. Получение 6α-[(4-фенил-1-пиперазинил)метил]-андрост-4-ен-3,17-диона (Ib. R = Ph)

В условиях примера 2, используя 0,55 мл (584 мг, 3,6 ммоль) 1-фенилпиперазина (IV, R = Ph), получали соединение Ib в виде светло-желтого порошка с количественным выходом, содержащего по данным ЯМР-спектроскопии ба-диастереомер.

ВЭЖХ/МС (C₃₀H₄₀N₂O₂) М: вычислено 460.7; найдено 461.1 [М+Н]⁺.

ЯМР ¹Н (500.13 МГц, CDCl₃, 5); 7-26-7.29 (м, 2Н, СН-4а (orto)), 6.94 (м, 2Н, СН-4а (meta)), 6,87 (м, 1Н, СН-4а (para)), 5.80 (с, 1Н, СН - 4), 3.19 (м, 4 Н, СН₂- 3а), 1.03 - 2.72 (м, 24 Н, СН₂ - 1, 2, 7, 11, 12, 15, 16, 1а, 2а; СН - 6, 8, 9, 14), 1.26 (с, 3Н, СН₃-19), 0.96 (с, 3Н, CH3-18).

ЯМР ¹³С (125.77 МГц, CDCl₃, α): 220.39 (СО-17), 199.40 (СО-3), 171.30 (С-5), 151.29 (С-4а (ipso)), 129.10 (СН-4а (meta)), 126.75 (СН-4), 119.75 (СН-4а (para)), 116.07 (СН-4а (orto)), 53.47 (СН-9), 50.99 (СН - 14), 20.28, 21.86, 31.29, 32,64, 34.02, 35.74, 37.60, 53.53, 55.15, 63.09 (СН₂ - 1, 2, 7, 11, 12, 15, 16, 1а, 2а, 3а), 47.54 (С-13), 41.34 (СН-6), 38.36 (С-10), 30.52 (СН-8), 19.56 (СН₃-19), 13.85 (СН₃-18).

Пример 4. Получение 6α-[(4-бензил-1-пиперазинил)метил]-андрост-4-ен-3,17-диона (Ic. R = CH₂Ph)

В условиях примера 2, используя 635 мг (3,60 ммоль) 1-бензилпиперазина (IV, R = CH₂Ph), получили соединение 1 с в виде желтого аморфного порошка с количественным выходом, содержащего по данным ЯМР-спектроскопии бсс-диастереомер.

ВЭЖХ/МС (C₃₁H₄₂N₂O₂) М: вычислено 474.69, найдено 475 [М+Н]⁺.

ЯМР ¹Н (500.13 МГц, CDCl₃, δ): 7.33 (м, 2Н, СН-5а (orto)), 7.31 (м, 2Н, СН-5а (meta)), 7.26 (м,1Н, СН-5а (para)), 5.76 (с, 1Н, СН-4), 3.50 (с, 2Н, СН₂-4а), 2.67 (м, 1Н, СН-6), 1.30 - 2.50 (м, 26 Н, СН₂ - 1, 2, 7, 11, 12, 15, 16, 1 а, 2а, 3а, СН - 8, 14), 1.22 (с, 3Н, СН₃-19), 1.00 (м, 1Н, СН-9), 0.94 (с, 3Н, СН₃ -18).

ЯМР ¹³С (125.77 МГц, CDCl₃, δ): 220.47 (СО-17), 199.52 (СО-3), 171.44 (С-5), 138.04 (С-5а (ipso)), 129.28 (СН-5а (orto)), 128.22 (СН-5а (meta)), 127.08 (СН-5а (para)), 126.65 (СН-4), 53.17 (СН-9), 50.98 (СН-14), 47.53 (С -13), 41.32 (СН-6), 38.33 (С-10), 30.50 (СН-8), 20.25, 21.83, 31.27, 32,70, 34.01, 35.74, 37.59, 53.44, 63.06 (СН₂ - 1, 2, 7, 11, 12, 15, 16, 1а, 2а, 3а, 4а), 19.52 (СН₃-19), 3.83 (СН₃-18).

Пример 5. Изучение антимикробной активности заявляемых соединений общей Формулы I

Антибактериальную активность оценивали со следующими тест-штаммами: грамотрицательная бактерия Escherichia coli АТСС 25922; грамположительная бактерия Bacillus subtilis ATCC 6633; Staphylococcus aureus FDA 209P.

Тест-культуру В. subtilis ATCC 6633 выращивали на среде Гаузе 2 (г/л): триптон 2,5 (или 30 мл бульона Хоттингера), пептон - 5, хлорид натрия - 5, глюкоза - 10. 5. Aureus FDA 209Р выращивали на среде МПА, a E.coli АТСС 25922 выращивали на среде LB (триптон-соевый агар).

Противогрибковую активность соединений изучали методом диско-диффузионного анализа. В работе для проведения опытов использовали условно-патогенный штамм Aspergillus niger INA 00760. Гриб A. niger INA 00760 выращивали на PDA (картофельно-декстрозный агар; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США).

Культуры предварительно выращивали в пробирках со скошенным питательным агаром. После этого клетки суспендировали в физиологическом растворе до мутности 0,5 по стандарту МакФарланда (1,5 × 108 КОЕ/мл) и использовали в течение 15 мин. Использовали односуточные культуры бактерий и 5-суточную культуру гриба.

Пример 5.1. Изучение антибактериальной активности

Тестируемое соединение растворяли в ДМСО до концентрации 500 мкг на мл. Для теста использовали 100 мкл (0,1 мл) раствора, содержащего 50 мкг испытуемого соединения. Затем стерильные бумажные диски (фильтровальная бумага Ф ГОСТ 12026-76, Россия) пропитывали раствором исследуемого соединения в стерильных условиях. Планшеты инкубировали при 37°С и через 48 ч исследовали на наличие зоны ингибирования вокруг дисков, если она имелась. В качестве стандартного контрольного препарата в исследовании использовали композицию амоксициллин/клавулановая кислота (амоксициллин 20 мкг + клавулановая кислота 10 мкг /диск, Санкт-Петербургского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Россия). В анализе также использовали дополнительный контрольный диск без образца, но пропитанный эквивалентным количеством растворителя (ДМСО). Анализы проводили трижды в трехкратной повторности.

Зона ингибирования (мм) испытуемых соединений в отношении штаммов патогенных бактерий представлена в табл.1. Результаты оценки in vitro активности соединений общей формулы I в концентрации 50 мкг/диск показали наличие антибактериальной активности в отношении штамма Staphylococcus aureus FDA 209Р.

Пример 5.2. Изучение противогрибковой активности

Диски диаметром 6 мм, содержащие 40 мкл образца, помещали на чашки с агаром PDA (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Диаметр зон ингибирования измеряли через 48 ч при 28°С. Для теста использовали 100 мкл (0,1 мл) раствора, содержащего 50 мкг тестируемого стероида. Затем стерильные бумажные диски пропитывали раствором испытуемого соединения в стерильных условиях. Диски помещали на поверхность агаровых чашек, уже инокулированных спорами Aspergillus. Амфотерицин В (40 мкг/диск) и нистатин (80 мкг/диск) использовали в анализе в качестве препаратов сравнения. В анализе также использовали дополнительный контрольный диск без образца, но пропитанный эквивалентным количеством растворителя (ДМСО). Планшеты инкубировали при 37°С и исследовали через 24, 48 ч на наличие зоны ингибирования.

Зона ингибирования исследуемых соединений в отношении патогенных грибов показана в таблице. Результаты исследования антиаспергиллезной активности in vitro показывают, что соединения общей формулы I проявляют умеренную антиаспергиллезную активность в отношении условно-патогенного штамма, используемого в эксперименте. Следует отметить, что после инкубации зоны ингибирования A. niger INA 00760 оказались равными 9-10 мм для соединений общей формулы (I), тогда как андростендион оказался неактивен.

Результаты оценки антимикробной активности новых N-замещенных производных 6α-пиперазинометиландрост-4-ен-3,17-диона общей формулы I дают основание считать эти соединения перспективными биологически активными веществами, обладающими неспецифической антибактериальной активностью избирательного действия и противогрибковой активностью. Они могут быть использованы в качестве активных ингредиентов в лекарственных средствах для медицинского применения, в частности для терапии инфекционных заболеваний.

Группа изобретений относится к области химии и фармацевтики, а именно к соединениям N-замещенным производным 6α-пиперазинометиландрост-4-ен-3,17-диона общей формулы I, где R = СН₃, Ph, CH₂Pb, обладающим антибактериальной и противогрибковой активностью, а также к способу их получения. Группа изобретений обеспечивает соединение, обладающее противомикробным действием, и эффективный способ его получения. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 пр.

1. N-замещенные производные 6α-пиперазинометиландрост-4-ен-3,17-диона общей формулы I

где R = СН₃, Ph, CH₂Ph.

2. Соединения по п. 1, обладающие антимикробной активностью.

3. Соединения по п. 1 или 2, обладающие антибактериальной активностью в отношении штаммов рода Staphylococcus, например штамма Staphylococcus aureus FDA 209Р.

4. Соединения по любому из пп. 1-3, обладающие противогрибковой активностью в отношении штаммов рода Aspergillus, например штамма Aspergillus niger INA 00760.

5. Способ получения соединений по п. 1 из андрост-4-ен-3,17-диона формулы II,

включающий взаимодействие соединения II с триметилортоформиатом в присутствии кислотного катализатора с образованием 3-метоксиандроста-3,5-диен-17-она формулы III,

последующую конденсацию соединения III с реагентом, образующимся in situ из формальдегида и гидрохлорида N-замещенного пиперазина общей формулы IV,

где R = СН₃, Ph, CH₂Ph.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что получаемые соединения по п. 1 общей формулы I представляют собой индивидуальные 6α-диастереомеры.

7. Способ по п. 5 или 6, где енолизацию Δ⁴-3-кетосистемы соединения II для взаимодействия с триметилортоформиатом с образованием соединения III проводят действием хлористого водорода, растворенного в безводном апротонном растворителе, в качестве которого используют циклические эфиры, например 1,4-диоксан.

8. Способ по любому из пп. 5-7, где получение соединения III проводят в среде безводного апротонного растворителя, в качестве которого используют циклические эфиры, например 1,4-диоксан.

9. Способ по любому из пп. 5-8, характеризующийся тем, что конденсацию соединения III с реагентом, образованным in situ из формальдегида и гидрохлорида N-замещенного пиперазина общей формулы N, проводят в среде протонного растворителя, в качестве которого используют алифатический спирт, например метанол.