Способ дифференциальной диагностики плоскоклеточного рака языка и доброкачественного новообразования языка Российский патент 2025 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6886 

Изобретение относится к медицине, а именно к молекулярной биологии, онкологии, и может быть использовано для малоинвазивной диагностики плоскоклеточного рака языка различных гистологических подтипов. Плоскоклеточные опухоли слизистой оболочки полости рта составляют до 95% всех злокачественных новообразований этой локации. Среди них основная доля приходится на опухоли языка и дна ротовой полости (см. Льянова А.А., Владимирова Л.Ю., Франциянц Е.М., Кутилин Д.С., Енгибарян М.А. Молекулярные основы современной таргетной терапии плоскоклеточного рака языка и слизистой дна полости рта моноклональными антителами. Злокачественные опухоли. 2017; 7 (4): 77-87.). Последние десятилетия рак языка сохраняет лидирующие позиции в общей структуре заболеваемости злокачественными опухолями головы и шеи, ежегодно приводя к более чем 135000 летальных случаев (см. Кутилин Д.С., Данилова А.Э., Максимов А.Ю., Снежко А.В., Енгибарян М.А. Особенности транскрипционной активности генов в различных гистологических подтипах плоскоклеточного рака языка. Успехи молекулярной онкологии. 2023;10(1):57-78).

Рак языка имеет клинически непредсказуемый прогноз из-за повышенной частоты скрытых метастазов у пациентов с небольшими первичными опухолями и отсутствием клинических признаков метастатического заболевания (см. Byers R.M., El-Naggar A.K., Lee Y.Y., Rao B., Fornage B., Terry N.H., Sample D., Hankins P., Smith T.L., Wolf P.J. Can we detect or predict the presence of occult nodal metastases in patients with squamous carcinoma of the oral tongue. Head Neck. 1998; 20(2):138-144). Гистопатологически наиболее частым вариантом является обычный тип плоскоклеточного рака языка (см. Ion Ciucă Mărăşescu F.I., Marasescu P.C., Matei M., Florescu A.M., Margaritescu C., Petrescu S.M.S., Dumitrescu C.I. Epidemiological and Histopathological Aspects of Tongue Squamous Cell Carcinomas-Retrospective Study. Curr Health Sci J. 2018; 44(3):211-224.). Из-за высокой смертности и низкой частоты излечения плоскоклеточный рак языка представляет собой серьезную проблему общественного здравоохранения с большим индивидуальным и социально-экономическим значением (см. Hema K.N., Smitha T., Sheethal H.S., Mirnalini S.A. Epigenetics in oral squamous cell carcinoma. J Oral Maxillofac Pathol. 2017; 21(2):252-259.).

Развитие и прогрессирование предраковых заболеваний языка обусловлено не только необратимыми изменениями в последовательности ДНК (мутации генов), приводящими как к активации онкогенов, так и к инактивации генов-супрессоров опухолей, но также и изменениями в экспрессии и копийности генов (см. Lingen M.W., Pinto A., Mendes R.A., Franchini R., Czerninski R., Tilakaratne W.M. et al. Genetics/epigenetics of oral premalignancy: Current status and future research. Oral Dis. 2011; 17(1):7-22; Khan S.S., Kamboj M., Verma R., Kumar M. Epigenetics in oral cancer-neoteric biomarker. J Oral Med Oral Surg Oral Pathol Oral Radiol. 2016; 2:62-5).

Выбор метода лечения обычно зависит от клинико-морфологических параметров опухоли: локализации и объема опухолевого очага, наличия метастазов в лимфатических узлах и степени гистологической дифференцировки ткани. Однако на ранних стадиях опухолевого процесса эти прогностические факторы часто неэффективны. Для решения подобных практических задач возникает потребность в дополнительных прогностических факторах, которые могли бы отражать фактическое состояние опухолевой прогрессии и давать объективный прогноз развития болезни. Такими факторами могут выступать определенные геномные и транскриптомные характеристики опухолей, определяющие особенности патогенеза в каждом конкретном случае (см. Владимирова Л.Ю., Льянова А.А., Франциянц Е.М., Кутилин Д.С., Енгибарян М.А. Молекулярные механизмы резистентности к терапии моноклональными антителами у больных плоскоклеточным раком языка и слизистой дна полости рта Злокачественные опухоли. 2018; 4:13-25).

Транскрипционная активность генов регулируется множеством механизмов, одним из которых является изменение копийности генов.

Для эффективной и одновременно малоинвазивной ранней диагностики плоскоклеточного рака языка большим потенциалом обладает определение молекулярных маркеров во внеклеточной ДНК плазмы крови. К внеклеточной ДНК (внДНК) относится ядерная и митохондриальная ДНК из соматических и опухолевых клеток, подвергшихся апоптозу или некрозу; ДНК из клеток крови, вирусная и бактериальная ДНК (см. Кутилин Д.С., Айрапетова Т.Г., Анистратов П.А., Пыльцин С.П., Лейман И.А., Чубарян А.В., Туркин И.Н., Водолажский Д.И., Николаева Н.В., Лысенко И.Б. Изменение относительной копийности генетических локусов во внеклеточной ДНК у пациентов с аденокарциномой легкого. Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. 2017. № 3-2 (195-2). С. 74-82).

Анализ баз данных TCGA и многоэтапный лабораторный скрининг позволил выделить гены (MMP1 и MAL), показатель копийности которых можно использовать для малоинвазивной диагностики плоскоклеточного рака языка.

Копийность генов (Copy Number Variation (CNV)) - разновидность генетического полиморфизма, сущность которого заключается в изменении числа копий определенного гена и его продукта - белка или не кодирующей РНК (см. Кутилин Д.С., Айрапетова Т.Г., Анистратов П.А., Пыльцин С.П., Лейман И.А., Карнаухов Н.С., Кит О.И. Изменение копийности генов в опухолевых клетках и внеклеточной ДНК у больных аденокарциномой лёгкого // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2019. 167(6). С. 731-738). CNV может выступать в качестве высокоспецифичного биологического маркера, позволяющего осуществлять раннюю диагностику (см. Колесников Е.Н., Максимов А.Ю., Кит О.И., Кутилин Д.С. Зависимость общей и без рецидивной выживаемости больных от молекулярно-генетического подтипа плоскоклеточного рака пищевода. Вопросы онкологии. 2019. 65(5). С. 691-700).

Ген MMP 1 (CLGN, CLG, matrix metallopeptidase 1) кодирует интерстициальную коллагеназу, также известную как коллагеназа фибробластов или матриксная металлопротеиназа-1. Этот фермент при нормальных физиологических процессах (эмбриональное развитие, размножение и ремоделирование тканей) участвует в разрушении внеклеточного матрикса. Играет важную роль процессах развития артрита и при метастазировании (30).

Ген MAL кодирует высокогидрофобный интегральный мембранный белком, принадлежащим к семейству протеолипидов. Белок локализован в эндоплазматическом ретикулуме Т-клеток и является кандидатом на роль линкерного белка в передаче сигнала Т-клетками. Белок играет роль в формировании, стабилизации и поддержании обогащенных гликосфинголипидами мембранных микродоменов (42).

Поэтому, в качестве маркеров для малоинвазивной диагностики плоскоклеточного рака языка допустимо использование показателя относительной копийности генов MMP1 и MAL.

Из патентных источников известны следующее изобретения:

1. «Способ дифференциальной диагностики воспаления и плоскоклеточного рака слизистой оболочки языка по содержанию биомаркеров в ротовой жидкости пациента» (см. патент ⁽¹⁹⁾ RU ⁽¹¹⁾ 2 786 804 ⁽¹³⁾ C1 от 26.12.2022, Бюл. № 36). Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики воспаления и плоскоклеточного рака слизистой оболочки языка по содержанию биомаркеров в ротовой жидкости пациента. Применяют метод иммуноферментного анализа на плашке на основе моноклональных антител с последующим анализом результатов исследований. В качестве биомаркеров выбирают матриксную металлопротеиназу 2 (ММП 2) и матриксную металлопротеиназу 8 (ММП 8), определяют их количественное содержание в ротовой жидкости пациента. При определении содержания ММП 2 в количестве 115,52-185,86 нг/мл и ММП 8 в количестве 5,53-7,07 нг/мл диагностируют воспаление слизистой оболочки языка. При определении содержания ММП 2 в количестве 8,89-19,75 нг/мл и ММП 8 в количестве 1441,07-1848,89 нг/мл диагностируют плоскоклеточный рак слизистой оболочки языка.

2. «Способ дифференциальной диагностики рецидивных плоскоклеточных опухолей полости рта с фиброзом и гиперкератозом» (см. патент ⁽¹⁹⁾ RU ⁽¹¹⁾ 2 702 974 ⁽¹³⁾ C1 от 14.10.2019 Бюл. № 29). Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии. Способ дифференциальной диагностики рецидива плоскоклеточного рака полости рта и гиперкератозом или фиброзных изменений заключается в проведении ультразвукового исследования полости рта. Отличие предложенного способа в том, что ультразвуковое исследование проводят в В-режиме, дополнительно проводят режим контрастирования, используя 2,4 мл эхоконтрастного препарата (ЭКП).

3. «Способ прогнозирования неблагоприятного течения новообразований слизистой оболочки полости рта» ((19) RU (11) 2 678 041 (13) C1 22.01.2019 Бюл. № 3 ) Изобретение относится к медицине, а именно к онкостоматологии и лабораторной диагностике, и может быть использовано для прогнозирования неблагоприятного течения новообразований слизистой оболочки полости рта (СОПР). Определяют в ротовой жидкости ДНК вирусов Эпштейна-Барр (EBV), вируса простого герпеса 1 типа (HSV), наличие изъязвления ткани опухоли. Устанавливают стаж работы в условиях химического производства, вредного для слизистой оболочки полости рта (вредное производство). Рассчитывают величину y - вероятность неблагоприятного течения - по заявленной формуле. Нормализуют данный показатель в проценты. При значении y от 1 до 30% определяют низкую степень риска неблагоприятного течения новообразований СОПР. При y 31-70% - среднюю степень риска. При значении y более 70% - высокую степень риска неблагоприятного течения новообразований СОПР. Способ позволяет провести прогнозирование неблагоприятного течения новообразований СОПР за счет оценки комплекса наиболее значимых факторов риска

Однако описанные выше способы принципиально отличаются от нашего, обладают меньшей точностью, чувствительностью и специфичностью, чем предлагаемый нами.

Анализ патентных источников (www.fips.ru) также показал отсутствие действующих патентов и заявок на «Способ малоинвазивной диагностики плоскоклеточного рака языка различных гистологических подтипов на основании определения уровня копийности генов MMP1 и MAL».

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание нового, простого в исполнении и точного способа с уникальными высокоспецифичными последовательностями синтетических олигонуклеотидов (праймеров) для малоинвазивной диагностики плоскоклеточного рака языка различных гистологических подтипов.

Технический результат достигается тем, что проводят определение показателя копийности генетических локусов MMP1 и MAL относительно референсного гена GAPDH методом ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA-Green и высокспецифичных праймеров на матрице выделенной внДНК, рассчитывают относительную копийности гена (rC) по формуле rC = E^-ΔCt, где Ct - медиана сигналов флюоресценции, ΔC_t = C_t(ген-мишень) – C_t(референсный ген), и сравнивают полученные значения rC с прогностическим интервалом копийности, и при значениях rC_MMP1 >5,52*10^-3 и rC_MAL < 4,01*10^-4 диагностируют у пациента плоскоклеточный рак языка, а при значениях rC_MMP1 < 5,05^-3*10^-3 и rC_MAL > 4,21*10^-4 у пациента диагностируют доброкачественное новообразование языка.

Сущность способа заключается в том, что образцы крови (6 мл крови и 2 мл 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,5, с 0,15 М NaCl и 50 мМ ЭДТА) разделяют на плазму и фракцию клеток центрифугированием в течение 15 минут при 600 g и 5^ºС. Из плазмы крови выделяют внДНК фенол-хлороформным методом и проводят амплификацию с высокоспецифичными праймерами для локусов MMP, MAL и GAPDH, анализируют первичные данные и вычисляют относительную копийность (rC) по формуле E^-ΔCt, где ΔC_t =C_t(ген-мишень) – C_t(референсный ген). Затем сравнивают полученные значения rC с прогностическими значениями копийности, и при значениях rC_MMP1>5,52*10^-3 и rC_MAL<4,01*10^-4 диагностируют у пациента плоскоклеточный рак языка, а при значениях rC_MMP1<5,05^-3*10^-3 и rC_MAL>4,21*10^-4 у пациента диагностируют доброкачественное новообразование языка (чувствительность 90%).

Заявленный анализ основан на определении количества копий генов MMP и MAL относительно референсного гена GAPDH во внДНК плазмы крови доноров, и последующем сравнении полученных значений интервалов копийности rC для этих генов с характерными для плоскоклеточный рак языка.

Заявленный способ включает следующие приёмы:

• выделение внеклеточной ДНК из плазмы крови с помощью метода фенол-хлороформной экстракции;

• определение относительной копийности генетических локусов MMP и MAL методом ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA-Green и специфичных праймеров на матрице выделенной внДНК;

• анализ первичных данных с помощью программного продукта амплификатора;

• расчёт относительной копийности гена (rC) на основании соотношения сигналов, продуцируемых амплификатами изучаемой и референсной последовательностей,

• сравнением rC пробы с прогностическими значениями копийности для больных плоскоклеточным раком и доброкачественными новообразованиями языка.

Для осуществления способа были разработаны специфичные олигонуклеотидные прямые и обратные праймеры для локусов MMP и MAL, GAPDH. Дизайн праймеров (см. таблица 1) осуществлялся с использованием программы Primer-BLAST и базы данных NCBI GenBank.

Таблица 1

Праймеры для способа малоинвазивной диагностики плоскоклеточного рака языка различных гистологических подтипов на основании определения уровня копийности генов MMP1 и MAL

Наименование праймеров Последовательность №ID MMP1_F
MMP1_R AGCCATCACTTACCTTGCACT GACACCACACCCCAGAACAG SEQ ID №1
SEQ ID №2 MAL_F
MAL_R GGAGCCAGCGAGAGGTCTG GTGAAGACCGAGAAGCCACT SEQ ID №3
SEQ ID №4 GAPDH_F
GAPDH_R GCTGAACGGGAAGCTCACT
GCAGGTTTTTCTAGACGGCAG SEQ ID №5
SEQ ID №6

Заявленный способ осуществляется следующим образом:

На первом этапе образцы крови (6 мл крови и 2 мл 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,5, с 0,15 М NaCl и 50 мМ ЭДТА) разделяют на плазму и фракцию клеток центрифугированием в течение 15 минут при 600 g и 5°С.

Из плазмы крови внДНК выделяют фенол-хлороформным методом в модификации: к плазме крови добавляют равный объем лизирующего буфера (10 мМ TrisHCl pH=8.0, 1мМ ЭДТА, 2% SDS, 1,5% меркаптоэтанол) и 50 мкл протеиназы К, инкубируют в термостате при 58⁰С 30 минут; к полученному лизату добавляют равный объем щелочного фенола и хлороформа (1:1), центрифугируют 30 минут 3000 об/мин при 5°С. После разделения фаз отбирают водную фазу в отдельную стерильную пробирку. К водной фазе добавляют равный объем 95% изопропилового спирта и раствор 5М NaCl до концентрации 100 mM, пробирку охлаждают до -20°С и инкубируют при этой температуре не менее 60 минут. Далее центрифугируют 20 минут при 12000 об/мин и -10°С, декантируют супернатант, а осадок промывают 80% этиловым спиртом, центрифугированием удаляют остатки этанола, высушивают осадок в твердотельном термостате и растворяют в 10 мМ ТЕ-буфере. Для проведения ПЦР-РВ концентрацию ДНК в каждом образце нормализуют до 0,7 нг/мкл.

Амплификацию проводят в 20 мкл ПЦР-смеси, содержащей 1,5 нг внДНК, 0,20 мМ dNTPs, 2,5 мМ MgCl₂, 1х ПЦР-буфер, 1х краситель EvaGreen, 0,2 е.а./мкл ДНК-полимеразы Thermus aquaticus и по 400 нМ прямого и обратного праймеров для референсного локуса или гена-мишени.

Количественную ПЦР-РВ амплификацию проводят на термоциклере по следующей программе: t=95°С в течение 4 мин. 40 циклов: t=95°С в течение 10 с, t=56°С (чтение сигнала) в течение 20 с, t=72°С в течение 25 с.

Относительная копийность локусов MMP1 и MAL вычисляется следующим образом: определяют C_t для каждого целевого локуса и референсного GAPDH, далее рассчитывается величина ΔC_t =C_t(ген-мишень - MMP1 и MAL) – C_t(референсный ген - GAPDH) и копийность генетического локуса относительно референсного гена (rC) по формуле E^-ΔCt (где E=1,9).

Сравниваются полученные значения rC с интервалом прогностического коэффициента копийности:

• при значениях rC_MMP1>5,52*10^-3 и rC_MAL<4,01*10^-4 диагностируют у пациента плоскоклеточный рак языка,

• при значениях rC_MMP1<5,05*10^-3 и rC_MAL>4,21*10^-4 у пациента диагностируют доброкачественное новообразование языка.

Предлагаемым способом было осуществлено обследование 100 доноров крови, у 35 из которых был диагностирован плоскоклеточный рак языка. Медиана возраста исследуемых составила 45,1±6,3 лет. У всех больных до хирургического вмешательства была взята кровь при помощи вакутейнера, получена плазма при помощи центрифугирования, из полученной плазмы была выделена внДНК (как описано в способе).

Для доказательства прогностической ценности предлагаемого способа приводим следующие примеры.

Пример 1. Пациентка В., 1951 года рождения. В марте 2024 года обратилась на обследование в ГБУ РО "Онкодиспансер".

28.03.2024 выполнена биопсия опухоли языка, гистологический анализ - комплексы умереннодифференцированной плоскоклеточной карциномы.

19.04.2024 самостоятельно обратилась в КДО "НМИЦ онкологии" для обследования. Больная дообследована, поставлен диагноз: ЗНО языка с mts в л/узлы шеи справа StIII T3N1M0, кл. гр.2. КТ (КТ шеи с болюсным внутривенным контрастированием) от 19.04.2024 - заключение: опухоль тела и корня языка справа. Шейная лимфаденопатия справа. УЗИ мягких тканей от 19.04.2024 - заключение: Образование мягких тканей языка. УЗИ забрюшинных лимфоузлов от 18.04.2024 - патологии забрюшинных лимфоузов не выявлено. УЗИ ОБП от 3.04.2024 - признаки умеренных диффузных изменений паренхимы печени и поджелудочной железы. УЗИ лимфоузов шеи от 18.04.2024 - аденопатия подчелюстных лимфоузлов по типу реактивно измененных, аденопатия единичного шейного лимфоузла слева. Рекомендовано хирургическое лечение.

До хирургического вмешательства была взята кровь при помощи вакутейнера, получена плазма при помощи центрифугирования, из полученной плазмы была выделена внДНК. Были получены значения rC_MMP1=8,01*10^-3 и rC_MAL=2,97*10^-4, что соответствует показателям rC характерным для плоскоклеточного рака языка.

Операция 06.05.2024: иссечение образования мягких тканей шеи справа с микрохирургической пластикой, гемиглосэктомия справа, постановка временной трахеостомы. Протокол ПАО от 17.05.2024: Опухоль языка - высокодифференцированная (G1) плоскоклеточная ороговевающая карцинома с резко выраженным хроническим воспалением, размером 3х1 см, глубина инвазии 1,2 см, с признаками лимфоваскулярной и периневральной инвазии. Больной показано адъювантное одновременное химиолучевое лечение.

Пример 2. Пациентка А., 1973 года рождения. Образование на языке появилось 5 лет назад, после травмы, без динамики к росту.

Обратилась к онкологу в апреле 2024 года, направлена в НМИЦ онкологии.

До хирургического вмешательства была взята кровь при помощи вакутейнера, получена плазма при помощи центрифугирования, из полученной плазмы была выделена внДНК. Были получены значения rC_MMP1=1,27*10^-3 и rC_MAL=9,02*10^-4, что соответствует показателям rC характерным для доброкачественных новообразований языка.

25.04.2024 г. выполнено удаление образования кончика языка. Гистологический анализ от 08.05.2024г. - Фибропапиллома.

Заявляемый способ, включает разработанные нами праймеры и является экономически оправданным для диагностики плоскоклеточного рака языка, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии (ПЦР), без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью и специфичностью, осуществление анализа возможно с плазмой крови, занимает не более 5 часов.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ

малоинвазивной диагностики плоскоклеточного рака языка различных

гистологических подтипов на основании определения уровня копийности

генов MMP1 и MAL.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-09-02">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский

центр онкологии" Министерства здравоохранения Российской

Федерации</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Natsional meditsinskiy

issledovatelskiy tsentr onkologii</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Кутилин Денис

Сергеевич</InventorName>

<InventorNameLatin>Kutilin Denis</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ малоинвазивной диагностики

плоскоклеточного рака языка различных гистологических подтипов на

основании определения уровня копийности генов MMP1 и

MAL</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>6</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agccatcacttaccttgcact</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gacaccacaccccagaacag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggagccagcgagaggtctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtgaagaccgagaagccact</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gctgaacgggaagctcact</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcaggtttttctagacggcag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики плоскоклеточного рака языка и доброкачественного новообразования языка. Из плазмы крови выделяют внеклеточную ДНК (внДНК). Проводят определение копийности генов MMP1 и MAL относительно референсного гена GAPDH методом ПЦР-РВ в присутствии высокоспецифичных праймеров на матрице выделенной внДНК. Рассчитывают относительную копийность генов (rC) и сравнивают полученные значения rC с прогностическим интервалом копийности. При значениях rC_MMP1>5,52*10^-3 и rC_MAL<4,01*10^-4 диагностируют плоскоклеточный рак языка. При значениях rC_MMP1<5,05*10^-3 и rC_MAL>4,21*10^-4 диагностируют доброкачественное новообразование языка. Способ обеспечивает простую, точную и малоинвазивную диагностику плоскоклеточного рака языка за счет определения копийности генов MMP1 и MAL в крови. 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр.

1. Способ дифференциальной диагностики плоскоклеточного рака языка и доброкачественного новообразования языка на основании определения уровня копийности генов MMP1 и MAL, включающий выделение внеклеточной ДНК (внДНК) из плазмы крови, определение копийности генов MMP1 и MAL относительно референсного гена GAPDH методом ПЦР-РВ в присутствии высокоспецифичных праймеров на матрице выделенной внДНК, после чего рассчитывают относительную копийность генов (rC) по формуле rC = 1,9^-ΔCt, где Ct - медиана сигналов флюоресценции, ΔCt = Ct(ген-мишень) – Ct(GAPDH), и сравнивают полученные значения rC с прогностическим интервалом копийности, и при значениях rC_MMP1>5,52*10^-3 и rC_MAL<4,01*10^-4 диагностируют у пациента плоскоклеточный рак языка, а при значениях rC_MMP1<5,05*10^-3 и rC_MAL>4,21*10^-4 у пациента диагностируют доброкачественное новообразование языка.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для оценки уровня копийности гена MMP1 используют праймеры SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для оценки уровня копийности гена MAL используют праймеры SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для оценки уровня копийности гена GAPDH используют праймеры SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6.