Способ обнаружения гена антибиотикоустойчивости bla-OXA-1 в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе Российский патент 2025 года по МПК C12N15/11 C12N15/113 C12N9/22 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, а именно к числу средств направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas 12 в составе рибонуклеопротеиновых комплексов для выявления (обнаружения, детекции) гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, а также к диагностическим способам и наборам.

Изобретение позволяет in vitro выявлять единичные копии гена антибиотикоустойчивости bla-OXA-1.

Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для детекции гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 после проведения специфической амплификации фрагментов гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1. Амплификация при этом может быть проведена различными способами, среди которых полимеразная цепная реакция (PCR); петлевая изотермическая амплификация (LAMP); геликаза-зависимая амплификация (HDA); рекомбиназа-опосредованная амплификация (RPA); амплификация со смещением цепи (SDA); амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA); опосредованная транскрипцией амплификация (ТМА); амплификация, опосредованная никирующим ферментом (NEAR); круговая амплификация (RCA) и многие другие виды амплификации.

Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения на основе CRISPR технологий для совершенствования методов диагностики инфекционных заболеваний.

Для решения эпидемиологических задач по расшифровке вспышек инфекционных болезней, выявления и идентификации возбудителя, а также детекции специфических бактериальных генов необходимы разработка и внедрение в практику работы надзорных и мониторинговых служб современных технологий молекулярной эпидемиологии. Одной из таких технологий является использование элементов генетического редактирования системы CRISPR-Cas. Данная технология развивается достаточно эффективно в отношении создания средств лечения некоторых болезней, несмотря на ряд трудностей, связанных с возникновением непредвиденных мутаций. При углубленных исследованиях в области применения CRISPR-Cas системы, было выяснено, что она может быть использована для тонких диагностических процедур при выявлении возбудителя/ей инфекции у человека, а также их генотипирования.

В 2018 году было показано, что один из ферментов CRISPR системы - Cas12 после распознавания своей целевой ДНК-мишени начинает неспецифически гидролизовать одноцепочечную ДНК. Такое свойство Cas12 можно использовать в качестве индикатора присутствия определенной мишени, например, генома вируса или бактерии. Исследователи использовали это открытие для создания технологической платформы обнаружения нуклеиновых кислот, известной как DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter - ДНК-нацеленная эндонуклеаза CRISPR транс репортер). Впервые DETECTR была использована для выявления и генотипирования вируса папилломы человека (HPV). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Cas12a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте HPV, флуоресцентную репортерную молекулу. Технология DETECTR используется для обнаружения целевой ДНК-мишени после предварительной амплификации [J.S. Chen, Е. Ma, L.B. Harrington, М. Da Costa, X. Tian, J.M. Palefsky, J.A. Doudna, CRISPR-Cas 12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity, Science 360 (6387) (2018) 436-439].

He менее важным приложением системы CRISPR-Cas является идентификация бактериальных патогенов и детекция специфических бактериальных генов. Так, например, с помощью платформы SHERLOCK удалось корректно генотипировать ряд штаммов Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa при низкой перекрестной реактивности. Кроме того, платформа SHERLOCK использована для дифференциации клинических изолятов Klebsiella pneumoniae с двумя различными генами антибиотикоустойчивости, что открывает значительные перспективы к созданию мультиплексных систем для одновременной идентификации бактериальных патогенов и выявления у них генов антибиотикоустойчивости.

В связи с этим крайне актуальной является задача разработки новых эффективных методик выявления генов антибиотикоустойчивости у бактериальных патогенов, основанных на генетических технологиях, таких как CRISPR-Cas.

Из уровня техники известны научные статьи, описывающие обнаружение гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 в биологическом материале [Colom К., Perez J., Alonso R., Fernandez-Aranguiz A., Larino E., Cisterna R. Simple and reliable multiplex PCR assay for detection of blaTEM, bla(SHV) and bla-OXA-1 genes in Enterobacteriaceae. FEMS Microbiol Lett. 2003; 223 (2): 147-151. doi:10.1016/S0378-1097(03)00306-9; Ogutu J.O., Zhang Q., Huang Y. et al. Development of a multiplex PCR system and its application in detection of blaSHV, blaTEM, blaCTX-M-1, blaCTX-M-9 and bla-OXA-1 group genes in clinical Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli strains. J Antibiot (Tokyo). 2015; 68 (12): 725-733. doi:10.1038/ja.2015.68]. Однако в приведенных публикациях отсутствует информация о чувствительности представленных методов. Также известна публикация, описывающая выявление родственных генов антибиотикоустойчивости семейства bla-ОХА методом ПЦР, чувствительность которого составляет 3,2 копиии/реакция [Probst К., Boutin S., Bandilla М., Heeg К., Dalpke А.Н. Fast and automated detection of common carbapenemase genes using multiplex real-time PCR on the BD MAX™ system. J Microbiol Methods. 2021;185:106224. doi:10.1016/j.mimet.2021.106224].

До сих пор большинство наборов для обнаружения бета-лактамаз расширенного спектра, к которым в том числе относится бета-лактамаз а, кодируемая геном bla-ОХА-1, основаны на методологии диффузионного теста в агаре и определении изоэлектрической точки, которая обычно считается достаточной для идентификации штаммов, продуцирующих бета-лактамазы расширенного спектра. Однако из-за появления большого количества различных бета-лактамаз bla-SHV, bla-ТЕМ и bla-СТХ-М изоэлектрофокусирование, по-видимому, не является подходящим методом для установления фенотипа бета-лактамаз расширенного спектра. Кроме того, описанные методы требуют продолжительного времени, специализированного оборудования, а также квалифицированного персонала (микробиология).

Ближайшими аналогами заявляемого решения являются изобретения по патентам RU 2734520 (дата приоритета 15.04.2020) направленное на получение направляющих РНК, предназначенных для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения для выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 (металло-бета-лактамаза класс В VIM-2) Pseudomonas aeruginosa; RU 2782588 (дата приоритета 27.12.2021), раскрывающее техническую возможность получения направляющих РНК, предназначенных для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения для выявления гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus на основе CRISPR технологий; RU 2791880 (дата приоритета 27.12.2021), раскрывающее возможность получения направляющих РНК, предназначенных для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения для выявления exoU, кодирующего экзотоксин системы секреции третьего типа, Pseudomonas aeruginosa на основе CRISPR технологий. Однако, для расширения спектра подобных диагностических систем и совершенствования методов диагностики инфекционных заболеваний, эпидемиологического надзора и контроля за распространением антибиотикоустойчивых микроорганизмов необходимо разрабатывать новые методы для выявления генов антибиотикоустойчивости патогенных микроорганизмов.

Исходя из вышеизложенного, возникает техническая проблема, заключающаяся в необходимости разработки и получения направляющих РНК для выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости bla-OXA-1, in vitro.

Предложенная технология перспективна для разнообразных применений, включая количественное определение ДНК/РНК, быструю мультиплексную детекцию экспрессии, другие виды чувствительной детекции, например, выявление загрязнения образцов нуклеиновыми кислотами. Технология, основанная на CRISPR-Cas, является многофункциональной, устойчивой к ошибкам технологией детекции ДНК, пригодной для быстрой постановки диагнозов, включая инфекционные заболевания, и генотипирования инфекционных агентов и выявление генов антибиотикоустойчивости и генов, кодирующих экзотоксины, бактериальных патогенов.

Применение предложенной технологии делает возможным создание диагностических систем нового поколения, которые будут обладать следующими свойствами:

• высокая чувствительность;

• возможность проведения диагностики у постели больного;

• возможность проведения диагностики в полевых условиях без применения специализированного высокотехнологичного оборудования;

• скорость и простота анализа;

• сниженная стоимость анализа;

• отсутствие необходимости оснащения диагностической лаборатории дорогостоящим оборудованием;

• отсутствие необходимости проведения выделения нуклеиновых кислот возбудителя.

Изобретение относится к новым средствам - направляющим РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas 12 для ультрачувствительного выявления, идентификации, обнаружения или детекции гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 в биологических образцах.

Технической задачей предложенного изобретения является разработка новых средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas 12 с белками Cas 12, такими как белок LbCpfl из Lachnospiraceae, для ультрачувствительного выявления гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1.

При осуществлении настоящего изобретения, согласно приведенной в формуле изобретения совокупности существенных признаков, достигается неожиданный технический результат возможность ультрачувствительного выявления гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 до единичных копий гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 в одной реакции. Изобретение обеспечивает повышение эффективности выявления гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 до 2,5 раз.

Технический результат достигается за счет:

• разработки молекул направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas 12 для ультра чувствительного выявления гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, где указанные направляющие РНК выбраны из последовательностей SEQ ID NO: 1-3, способны связываться с целевыми высоко консервативными участками гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, содержат РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpfl из Lachnospiraceae, с обеспечением выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1.

• применения РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpfl из Lachnospiraceae, полученных согласно способу, разработанному авторами ранее (Патент RU 2707542, дата приоритета 28.03.2019), для создания рибонуклеопротеиновых комплексов (РПК) системы CRISPR-Cas, пригодных для детекции гена антибиотикоустойчивости bla-OXA-1 в ультра низких концентрациях (единичные копии).

• разработки набора специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 4-5, для предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1.

• оптимизации условий проведения предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1.

• определения условий проведения ультрачувствительной детекции гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 и установления последовательности стадий метода.

Направляющие РНК, согласно настоящему изобретению, соответствуют высоко консервативным фрагментам гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1. Наиболее предпочтительны направляющие РНК, распознающиеся РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpfl из Lachnospiraceae, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:

• SEQ ID NO: l;

• SEQ ID NO: 2;

• SEQ ID NO: 3;

• или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%,

•или комплементарной любой из них,

• или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.

Набор специфических олигонуклеотидов для проведения предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, согласно настоящему изобретению, соответствуют высоко консервативному участку гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1. Наиболее предпочтительны олигонуклеотиды, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:

• SEQ ID NO: 4;

• SEQ ID NO: 5;

• или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%,

• или комплементарной любой из них,

• или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.

Согласно предложенному изобретению, получают рибонуклеопротеиновые комплексы (РПК), состоящие из по меньшей мере одной направляющей РНК и РНК-направляемой ДНК-нуклеазы системы CRISPR-Cas LbCpfl из Lachnospiraceae, пригодные для использования для выявления гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 в ультранизких концентрациях (единичные копии).

Препараты РПК представляют собой растворы, содержащие направляющую РНК, выбранную из SEQ ID NO: 1-3, объединенную с белком системы CRISPR-Cas (LbCpfl из Lachnospiraceae) или лиофильно высушенные РПК.

Полученные направляющие РНК могут быть использованы в составе набора для обнаружения гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 с инструкцией по применению.

Способ обнаружения гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 предусматривает:

i) проведение предварительной амплификации материала образца от пациента, предположительно содержащего ген антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 с использованием одного или нескольких специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 4-5, с целью получения мишени - предварительно амплифицированного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1,

ii) приготовление реакционной смеси для детекции, содержащей мишень, полученную на стадии (i); рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR-Cas, сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpfl из Lachnospiraceae, и по меньшей мере одной направляющей РНК с SEQ ID NO: 1-3; флюоресцентный зонд и буфер для детекции,

iii) проведение 30-60 циклов детекции в реакционной смеси, полученной на стадии (ii), в амплификаторе,

с обнаружением таким образом гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1.

Предварительно амплифицированный фрагмент гена антибиотикоустойчивости bla-OXA-1, согласно предложенному способу, может быть представлен фрагментом размером 262 п.о. гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1.

Предложенный способ обеспечивает выявление гена антибиотикоустойчивости bla-OXA-1 в ультранизких концентрациях, вплоть до единичных копий.

Специфический олигонуклеотид для использования в способе выбирается из группы SEQ ID NO: 4-5 и используется для предварительной амплификации высоко консервативного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, который распознается рибонуклеопротеиновым комплексом.

Набор для использования в способе обнаружения гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 содержит рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR-Cas, сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpfl из Lachnospiraceae, и по меньшей мере одной направляющей РНК с SEQ ID NO: 1-3; флюоресцентный зонд, буфер для детекции и инструкцию по применению.

Набор может дополнительно включать компоненты для проведения предварительной амплификации высококонсервативного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, в том числе один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 4-5.

При этом по меньшей мере одна направляющая РНК в составе набора может находиться в комплексе с белком системы CRISPR-Cas (LbCpfl из Lachnospiraceae) в одном контейнере или отдельно в разных контейнерах.

Предложенная технология позволяет определить единичные копии гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 в биологических образцах пациента, выбранных из жидкости и/или ткани, предположительно содержащих ген антибиотикоустойчивости bla-OXA-1. Биологическим образцом может быть образец крови, сыворотки или плазмы крови, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов от пациента, которые могут быть использованы для анализа на наличие гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Визуализация амплифицированного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 (размером 262 п.о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов ОХА-1 for 2 и ОХА-1 rev 1 при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-8 обозначены:

1 - Продукт, полученный в ходе амплификации 1,25×10^б копий модельной матрицы pGEM-T-bla-OXA-1;

2 - Продукт, полученный в ходе амплификации 1,25×10⁵ копий модельной матрицы pGEM-T-bla-OXA-1;

3 - Продукт, полученный в ходе амплификации 1,25×10⁴ копий модельной матрицы pGEM-T-bla-OXA-1;

4 - Продукт, полученный в ходе амплификации 1250 копий модельной матрицы pGEM-T-bla-OXA-1;

5 - Продукт, полученный в ходе амплификации 125 копий модельной матрицы pGEM-T-bla-OXA-1;

6 - Продукт, полученный в ходе амплификации 12,5 копии модельной матрицы pGEM-T-bla-OXA-1;

7 - Продукт, полученный в ходе амплификации 1,25 копии модельной матрицы pGEM-T-bla-OXA-1;

8 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-bla-OXA-1;

М - стандарты молекулярных масс: снизу-вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).

Фиг. 2. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, обработанного рибонуклеопротеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA bla-ОХА-1 №63 и белок LbCpfl, на котором посредством графика визуализировано выявление фрагмента модельной матрицы pGEM-T-bla-OXA-1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpfl из Lachnospiraceae, содержащих направляющую РНК crRNA bla-ОХА-1 №63, где:

- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;

- по горизонтали указано время флуоресценции, в минутах;

- на кривых 9-16 показано количество копий нуклеиновой кислоты на реакцию, а именно:

9 - 1 250 000 копий/реакция;

10 - 125 000 копий/реакция;

11 - 12 500 копий/реакция;

12 - 1250 копий/реакция;

13 - 125 копий/реакция;

14 - 12,5 копий/реакция;

15 - 1,25 копий/реакция;

16 - К - (отрицательный контроль).

Фиг. 3. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, обработанного рибонуклеопротеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA bla-ОХА-1 №185 и белок LbCpfl, на котором посредством графика визуализировано выявление фрагмента модельной матрицы pGEM-T-bla-OXA-1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpfl из Lachnospiraceae, содержащих направляющую РНК crRNA bla-ОХА-1 №185, где:

- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;

- по горизонтали указано время флуоресценции, в минутах;

- на кривых 17-24 показано количество копий нуклеиновой кислоты на реакцию, а именно:

17 - 1 250 000 копий/реакция;

18 - 125 000 копий/реакция;

19 - 12 500 копий/реакция;

20 - 1250 копий/реакция;

21 - 125 копий/реакция;

22 - 12,5 копий/реакция;

23 - 1,25 копий/реакция;

24 - К - (отрицательный контроль).

Фиг. 4. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, обработанного рибонуклеопротеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA bla-ОХА-1 №221 и белок LbCpfl, на котором посредством графика визуализировано выявление фрагмента модельной матрицы pGEM-T-bla-OXA-1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpfl из Lachnospiraceae, содержащих направляющую РНК crRNA bla-ОХА-1 №221, где:

- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;

- по горизонтали указано время флуоресценции, в минутах;

- на кривых 25-32 показано количество копий нуклеиновой кислоты на реакцию, а именно:

25 - 1 250 000 копий/реакция;

26 - 125 000 копий/реакция;

27 - 12 500 копий/реакция;

28 - 1250 копий/реакция;

29 - 125 копий/реакция;

30 - 12,5 копий/реакция;

31 - 1,25 копий/реакция;

32 - К - (отрицательный контроль).

Фиг. 5. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, обработанного рибонуклеопротеиновыми комплексами, содержащим направляющие РНК crRNA bla-ОХА-1 №63, crRNA bla-ОХА-1 №185 и crRNA bla-ОХА-1 №221, где посредством графика визуализировано выявление фрагмента модельной матрицы pGEM-T-bla-ОХА-1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpfl из Lachnospiraceae, при этом:

- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;

- по горизонтали указано количество копий модельной матрицы в реакции;

- столбцом визуализирована эффективность выявления единичных копий фрагмента модельной матрицы pGEM-T-bla-OXA-1 с использованием crRNA bla-ОХА-1 №63;

- столбцом визуализирована эффективность выявления единичных копий фрагмента модельной матрицы pGEM-T-bla-OXA-1 с использованием crRNA bla-ОХА-1 №185;

- столбцом визуализирована эффективность выявления единичных копий фрагмента модельной матрицы pGEM-T-bla-OXA-1 с использованием crRNA bla-ОХА-1 №221.

Фиг. 6. Визуализация амплифицированного с клинических образцов фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 (размером 262 п.о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов OXA-l_for_2 и OXA-1_rev_1 при помощи электрофореза в агарозном геле.

Фиг. 7. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированного с клинических образцов фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, обработанного рибонуклеопротеиновыми комплексами, содержащим направляющие РНК crRNA bla-ОХА-1 №63, crRNA bla-ОХА-1 №185 и crRNA bla-ОХА-1 №221, где посредством графика визуализировано выявление фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae на ограниченной панели клинических образцов, при этом:

- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;

- по горизонтали указаны идентификаторы образца;

- столбцом показана эффективность выявления фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, содержащегося в составе препаратов, выделенных из клинических образцов, с использованием crRNA bla-ОХА-1 №63;

- столбцом показана эффективность выявления фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, содержащегося в составе препаратов, выделенных из клинических образцов, с использованием crRNA bla-ОХА-1 №185;

- столбцом показана эффективность выявления фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, содержащегося в составе препаратов, выделенных из клинических образцов, с использованием crRNA bla-ОХА-1 №221.

Примеры осуществления изобретения

ПРИМЕР 1: ПОДБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ-МИШЕНЕЙ В ГЕНЕ АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ BLA-ОХА-1 ДЛЯ СОЗДАНИЯ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК

Для подбора последовательностей-мишеней в гене антибиотикоустойчивости bla-OXA-1 для создания направляющих РНК были использованы современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Benchling (https://www.benchling.com/molecular-biology/). Был составлен перечень участков гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления в высоко консервативных участках (Таблица 1). Направляющие РНК, специфически узнающие высоко консервативные участки гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1-3.

ПРИМЕР 2: ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ BLA-OXA-1 МЕТОДОМ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ АМПЛИФИКАЦИИ

Подготовку материала для обнаружения гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 проводили методом предварительной амплификации. В качестве модельной матрицы, содержащей фрагмент гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, использовали плазмидную ДНК pGEM-T-bla-OXA-1, содержащую в своем составе фрагмент гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 размером 321 п.о.

Предварительную амплификацию участка, соответствующего фрагменту гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, проводили с использованием специфических олигонуклеотидов с SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5.

Продукт, кодирующий фрагмент гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, получали при проведении ПЦР с использованием специфических олигонуклеотидов ОХА-l_for_2 и OXA-1_rev_1 (ГенТерра, Россия) и полимеразы TaqF (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия). Размер амплифицированного фрагмента составлял 262 пары нуклеотидов.

Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов фрагментов гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1:

1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;

2. 40 циклов амплификации: 95°С - 15 сек, 55°С - 45 сек, 72°С - 30 сек;

3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.

В ходе подготовки материала для обнаружения гена антибиотикоустойчивости bla-OXA-1 методом предварительной амплификации проводили титрование модельной матрицы pGEM-T-bla-OXA-1 путем приготовления серийных разведений (Таблица 2).

Для оценки эффективности предварительной амплификации полученный фрагмент гена антибиотикоустойчивости bla-OXA-1 визуализировали при помощи электрофореза в агарозном геле (фиг. 1).

Подготовленный описанным способом материал использовали для экспериментов по выявлению гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpfl из Lachnospiraceae, содержащих направляющие РНК crRNA bla-ОХА-1 №63, crRNA bla-ОХА-1 №185 и crRNA bla-ОХА-1 №221, без предварительной очистки.

ПРИМЕР 3: СОЗДАНИЕ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ BLA-ОХА-1

В качестве направляющих РНК для обнаружения гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 были использованы специфические РНК-олигонуклеотиды, приведенные в Таблице 3.

Создание готового рибонуклеопротеинового комплекса, содержащего белок семейства CRISPR-Cas 12 LbCpfl из Lachnospiraceae, и направляющую РНК авторы проводили по стандартному протоколу с некоторыми модификациями [С.Anders, М. Jinek, In vitro enzymology of Cas9, Methods Enzymol. 546 (2014) 1-20, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-801155-0.00001-51]. Для формирования готового рибонуклеопротеинового комплекса 250 нг Cas-белка LbCpfl из Lachnospiraceae и направляющую РНК смешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Полученный таким способом рибонуклеопротеиновый комплекс готов для выявления гена антибиотикоустойчивости bla-OXA-1.

ПРИМЕР 4: ОБНАРУЖЕНИЕ ЕДИНИЧНЫХ КОПИЙ ГЕНА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ BLA-OXA-1 С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRTSPR7CAS НА ПРИМЕРЕ МОДЕЛЬНОЙ МАТРИЦЫ

Предварительно амплифицированный материал, полученный способом, описанным в Примере 2, использовали в качестве матрицы для обнаружения гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.

Для обнаружения гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas готовили реакционную смесь, содержащую следующие компоненты:

• 10×буфер (100 mM TrisHCl pH 8,0, 1 М NaC1);

• 50 mM MgCl₂ (конечная концентрация в реакционной смеси 10 mM);

• 250 нг рибонуклеопротеинового комплекса (LbCpfl из Lachnospiraceae и направляющие РНК crRNA bla-ОХА-1 №63, crRNA bla-ОХА-1 №185 и crRNA bla-ОХА-1 №221);

• 10 pmol флуоресцентный зонд (6FAM-TTATT-BHQ1);

• Мишень (предварительно амплифицированный фрагмент гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1);

• вода mQ.

Реакционные смеси, содержащие все необходимые компоненты, помещали в амплификатор QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США) и задавали следующие параметры реакции:

30-60 циклов:

1. 37°С - 35 сек,

2. 37°С - 25 сек, съемка флуоресценции.

В первую очередь были проведены эксперименты по обнаружению единичных копий гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, сформированных на основе LbCpfl из Lachnospiraceae, с использованием в качестве мишени модельной матрицы - плазмидной ДНК pGEM-T-bla-ОХА-1, содержащую в своем составе фрагмент гена антибиотикоустойчивости Ыа-ОХА-1 размером 321 п.о.

Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR-Cas обладают способностью выявлять единичные копии гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1. Типичные результаты анализа приведены на примерах профилей флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, обработанного рибонуклеопротеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК crRNA bla-ОХА-1 №63, crRNA bla-ОХА-1 №185 и crRNA bla-ОХА-1 №221 и белок LbCpfl, на Фиг. 2, Фиг. 3 и Фиг. 4, соответственно.

Отметим, что комплексы CRISPR-Cas 12 выявляют ген bla-ОХА-1 с различной эффективностью. Так, для crRNA bla-ОХА-1 №63 и crRNA bla-OXA-1 №221 в среднем уже на 5-м цикле анализа (5 минут) значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (1,25 копий/реакция) гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) минимум в пять раз, а к 8-му циклу (8 минут анализа) - в 10 и более раз. Тогда как для crRNA bla-ОХА-1 №185 значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (1,25 копий/реакция) гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) в 5 раз к 23 циклу (23 минут анализа) и в 10 и более раз - к 32 циклу (32 минуты).

В ходе работ была оценена эффективность выявления гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, содержащегося в составе модельной матрицы, с использованием различных направляющих РНК. Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR-Cas, сформированные на основе LbCpfl из Lachnospiraceae и направляющих РНК, выявляют ген антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 с различной эффективностью, и их можно расположить в следующем порядке по уменьшению активности: crRNA bla-ОХА-1 №63 ≈ crRNA bla-ОХА-1 №221>crRNA bla-OXA-1 №185 (Фиг. 5).

ПРИМЕР 5: ОБНАРУЖЕНИЕ ГЕНА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ BLA-OXA-1 С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS НА ОГРАНИЧЕННОЙ ПАНЕЛИ КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ

Разработанные направляющие РНК были апробированы на ограниченной панели клинических образцов (10 шт.), содержащих ген антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 (ранее подтверждено методом секвенирования следующего поколения).

Для обнаружения гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas была проведена предварительная амплификация фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1. Для проведения предварительной амплификации из клинических образцов 10 пациентов с помощью коммерчески доступного набора «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя были выделены препараты ДНК.

Продукт, кодирующий фрагмент гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, получали с помощью ПЦР с использованием специфических олигонуклеотидов ОХА-l_for_2 и OXA-1_rev_1 (ГенТерра, Россия) и визуализировали при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 6).

Полученный таким способом материал использовали в качестве матрицы для обнаружения гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.

Обнаружение гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas проводили способом, описанным в Примере 4.

В ходе проведенного анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR-Cas обладают способностью выявлять ген антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 в препаратах ДНК, выделенных из клинических образцов. При этом в среднем уже на 7 цикле (7 минут) анализа значение сигнала превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) более чем в 5 раз, а к 8 циклу (8 минут) анализа - более чем в 10 раз (Таблица 4).

Типичные результаты анализа приведены на примерах значений флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1 (10 независимых клинических образцов), обработанных рибонуклеопротеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК crRNA bla-ОХА-1 №63, crRNA bla-ОХА-1 №185 и crRNA bla-ОХА-1 №221 и белок LbCpfl, на Фиг. 7.

Эффективность выявления гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, содержащегося в составе препаратов ДНК, выделенных из клинических образцов, с использованием различных направляющих РНК в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, сформированных на основе LbCpfl из Lachnospiraceae, оцененная по соотношению значений сигнала к значению «шума» при детекции, можно представить в следующем порядке по убыванию: crRNA bla-ОХА-1 №221 > crRNA bla-ОХА-1 №63 > crRNA bla-ОХА-1 №185 (Таблица 4).

Таким образом, разработанные направляющие РНК позволяют ультрачувствительно выявлять единичные копии гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1, и способны обнаруживать его препаратах ДНК, выделенных из клинических образцов, после предварительной амплификации в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.2//EN" "ST26SequenceListing_V1_2.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_2" fileName="Sposob obnaruzheniya

gena antibiotikoustojchivosti bla-OXA-1 v ultranizkih koncentraciyah

i specificheskie oligonukleotidy dlya ispolzovaniya v sposobe"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="1.0.0"

productionDate="2024-09-25">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>n/n</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-09-25</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>n/n</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>n/n</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-09-25</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии

Роспотребнадзора</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FBUN CRIE</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ обнаружения гена

антибиотикоустойчивости bla-OXA-1 в ультранизких концентрациях и

специфические олигонуклеотиды для использования в

способе</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>5</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>blaOXA-1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aatttctactaagtgtagatggttatttcttgcgaaaccc</INSDSeq

_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>blaOXA-1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aatttctactaagtgtagataagctactttcgagccatgc</INSDSeq

_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>blaOXA-1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aatttctactaagtgtagatcgcaggaattgaatttgttc</INSDSeq

_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>OXA-1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agcaatcatacaccaaagacg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>OXA-1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tggctgagtttttaactggg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу обнаружения гена антибиотикоустойчивости bla-OXA-1. Указанный способ включает проведение предварительной амплификации материала от пациента с использованием одного или нескольких специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 4-5, с целью получения мишени, приготовление реакционной смеси для детекции, содержащей указанную мишень, рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR-Cas, сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae и по меньшей мере одной направляющей РНК c SEQ ID NO: 1-3; флюоресцентный зонд и буфер для детекции, проведение 30-60 циклов детекции в указанной реакционной смеси. Кроме того, изобретение также относится к специфическому олигонуклеотиду, выбранному из SEQ ID NO: 4-5, а также набору для использования в указанном способе. Настоящее изобретение обеспечивает значительное повышение эффективности выявления гена антибиотикоустойчивости bla-ОХА-1. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 табл., 5 пр.

1. Способ обнаружения гена антибиотикоустойчивости bla-OXA-1, содержащий:

i) проведение предварительной амплификации материала образца от пациента, предположительно содержащего ген антибиотикоустойчивости bla-OXA-1, с использованием одного или нескольких специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 4-5, с целью получения мишени - предварительно амплифицированного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-OXA-1,

ii) приготовление реакционной смеси для детекции, содержащей мишень, полученную на стадии (i); рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR-Cas, сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae и по меньшей мере одной направляющей РНК c SEQ ID NO:1-3; флюоресцентный зонд и буфер для детекции,

iii) проведение 30-60 циклов детекции в реакционной смеси, полученной на стадии (ii), в амплификаторе,

с обнаружением таким образом гена антибиотикоустойчивости bla-OXA-1.

2. Способ по п.1, где предварительно амплифицированный фрагмент гена антибиотикоустойчивости bla-OXA-1 представлен фрагментом размером 262 п.о. гена антибиотикоустойчивости bla-OXA-1.

3. Способ по п.1 или 2, где способ обеспечивает выявление гена антибиотикоустойчивости bla-OXA-1 в ультранизких концентрациях, вплоть до единичных копий ДНК.

4. Специфический олигонуклеотид, выбранный из SEQ ID NO: 4-5, для использования в способе по п.1, 2 или 3 для предварительной амплификации высококонсервативного фрагмента гена антибиотикоустойчивости bla-OXA-1, который распознается рибонуклеопротеиновым комплексом.

5. Набор для использования в способе по п.1, 2 или 3, содержащий один или несколько специфических олигонуклеотидов по п.4, рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR-Cas, сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae и по меньшей мере одной направляющей РНК c SEQ ID NO: 1-3; флюоресцентный зонд, буфер для детекции и инструкцию по применению.