РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pFUSE 1-68 MAR TSH, КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ БЕЛКА ТИРОТРОПИНА АЛЬФА, КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ rhTSHCHO, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pFUSE 1-68 MAR TSH МЕТОДОМ НУКЛЕОФЕКЦИИ И СЕКРЕТИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ТИРЕОТРОПНЫЙ ГОРМОН ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2025 года по МПК C12N15/16 C12N15/85 C07K14/59 C12N5/10 

Объектом изобретения являются рекомбинантная плазмидная ДНК pFUSE 1-68 MAR TSH, кодирующая кДНК генов альфа и бета субъединиц рекомбинантного тиротропина альфа, и клеточная линия rhTSHCHO, полученная трансформацией культуры клеток яичника китайского хомячка CHO DG44 методом нуклеофекции рекомбинантной плазмидной ДНК pFUSE 1-68 MAR TSH.

Тиреотропный гормон (тиротропина альфа, ТТГ, TSH) - это гликопротеин; углеводная часть субъединиц составляет более 10% их массы и необходимы для нормального тиреотропного действия и внутрисосудистой кинетики.

ТТГ связывается со специфическими рецепторами на поверхности эпителиальных клеток щитовидной железы и стимулирует выработку и активацию тироксина. Рецептор ТТГ представляет собой мембранный GPCR-рецептор, сопряженный с G-белком, который, в свою очередь, активирует аденилатциклазу и увеличивает потребление йода клетками железы. Дальнейшее увеличение уровня цАМФ обусловливает действие ТТГ на биосинтез трийодтиронина (Т3) и тироксина (Т4), которые являются важнейшими гормонами, регулирующими рост и развитие.

Ранее в клинической практике использовали ТТГ выделенный из гипофиза крупного рогатого скота. Так бычий ТТГ использовался для проверки функции щитовидной железы и увеличения поглощения радиоактивного йода у пациентов с раком щитовидной железы. Однако он вызывал побочные аллергические реакции, поэтому после развития технологий рекомбинантной ДНК и появлением возможности искусственного получения гормона от использования ТТГ крупного рогатого скота отказались. Рекомбинантный ТТГ человека (рчТТГ) имеет аминокислотную структуру, идентичную человеческому ТТГ гипофиза и производится модифицированными клеточными линиями на основе клеток китайского хомячка CHO.

Одним из самых известных препаратов рекомбинантного ТТГ человека является препарат Тироджин (rhTSH; Thyrogen®). Он был одобрен FDA США для диагностического использования у пациентов с раком щитовидной железы. Альфа и бета субъединицы Thyrogen® идентичны субъединицам ТТГ гипофиза человека. Thyrogen® имеет удельную активность примерно 4 МЕ/мг и является мощным стимулятором секреции T4, T3 и тиреоглобулина (Tg) у здоровых добровольцев. Он также увеличивает поглощение йодида щитовидной железы у пациентов с раком щитовидной железы или многоузловым зобом и у добровольцев, даже тех, кто подвергается воздействию больших количеств стабильного йодида. Пациенты с раком щитовидной железы, которым была проведена тиреоидэктомия и аблация радиоактивным йодом, но которые имеют риск развития остаточного рака щитовидной железы, являются кандидатами для введения рчТТГ для подготовки к сканированию всего тела с помощью йодида и измерению уровня ТГ в сыворотке. У пациентов с тиреоидэктомированным раком щитовидной железы, которые не могут секретировать ТТГ гипофизом после отмены гормонов щитовидной железы, рчТТГ является единственным приемлемым методом подготовки их к этим процедурам. рчТТГ, помимо того, что он полезен при лечении пациентов с раком щитовидной железы, потенциально полезен для проверки резерва щитовидной железы и для помощи в процедурах ядерной медицины, связанных с щитовидной железой.

В патенте US 6455282 (Genzyme Corporation, США) описаны биологически активные гетерополимерные белки, состоящие из множества субъединиц, в том числе ТТГ, и способы их получения. Показано, что обе субъединицы синтезируются в одной клетке, имеющей вектора экспрессии, содержащие гетерологичную ДНК, кодирующую субъединицы как в составе единой плазмидной ДНК, так и в составе разных плазмидных ДНК. Оба варианта предполагают использование последовательности позднего промотора вируса SV40 для экспрессии гена альфа субъединицы и промотора белка металлотионеина мыши. Также упоминается использование промотора BPV вируса папилломы быка. Действие патента завершено в 2019 году.

В патенте US 7479549 описана нуклеиновая кислота, имеющая последовательность, по меньшей мере на 98% гомологичную последовательности, которая кодирует α-субъединицу собачьего тиреотропного гормона. Изобретение в патенте также включает способ получения субъединицы рекомбинантного собачьего тиреотропного гормона (rcTSH) путем экспрессии последовательностей в трансгенной клетке насекомого, модифицированной сиалированными белками, и получения сиалилированной субъединицы rcTSH для использования в диагностике и лечении гипотиреоз у собак.

В патенте US 20110052591 описан чистый рекомбинантный ТТГ, полученный из клона, содержащего полную нуклеотидную последовательность для экспрессии ТТГ. Описаны полинуклеотидные и полипептидные последовательности, которые кодируют новые варианты белков бета-тиреотропного гормона мыши или человека, которые можно использовать в терапевтических, диагностических и фармакогеномных применениях для предотвращения, лечения или снижения тяжести заболеваний, связанных с тиреотропным гормоном-бета. Представлены варианты конструкций с использованием промотора цитомегаловируса человека.

В патенте US 20190062396 представлен способ получения рекомбинантного тиреоидного гормона человека. В патенте представлена генетическая конструкция, содержащая последовательности генов бета и альфа субъединиц ТТГ, разделенные последовательностью IRES (Internal Ribosome Entry Site - участок внутренней посадки рибосомы), под управлением единого промотора цитомегаловируса человека и терминатора гормона роста быка (BGH), а также последовательности селектирующего белка - дегидрофолатредуктазы (DHFR).

Применение классических подходов с использованием гена DHFR требует длительного времени селекции клона продуцента. Для технического решения проблемы длительного времени селекции клона продуцента была избрана стратегия использования нуклеотидной последовательности удлиненного участка внутренней посадки рибосомы и последовательности PEST в составе фьюжн-белка hDHFR-PEST, что обеспечивает пониженный уровень дегидрофолатредуктазы внутри клетки и приводит к более эффективной селекции в присутствии метотрексата, что позволяет получать линии-продуценты с максимальным уровнем секреции рекомбинантного белка.

Изобретение иллюстрируют следующими графическими материалами.

Рис. 1. Схема генетической конструкции - рекомбинантной плазмидной ДНК pFUSE 1-68 MAR TSH, с основными генетическими элементами и ключевыми сайтами гидролиза эндонуклеаз рестрикции.

Рис. 2. Схема селекции пула клеток, трансформированных рекомбинантной плазмидной ДНК pFUSE 1-68 MAR TSH.

Рис. 3. Электрофоретический анализ очищенного препарата тиротропина альфа, полученного в результате культивирования клеточной линии rhTSHCHO

В результате решения заявленной технической проблемы получают следующий технический результат:

1. Рекомбинантную плазмидную ДНК pFUSE 1-68 MAR TSH SEQ ID NO: 1, содержащую нуклеотидные последовательности обоих субъединиц тиротропина альфа человека в составе единой мРНК, предпочтительна в настоящем изобретении, т.к. позволяет синтезировать каждой трансформированной единичной клеткой обе субъединицы тиротропина альфа, что уменьшает гетерогенность пула трансформированных клеток, и содержащую:

- нуклеотидную последовательность присоединения к ядерному матриксу MAR1-68, позволяющую повысить продукцию целевого белка за счет как увеличения уровня транскрипции расположенного в непосредственной близости гена, так и за счет большей стабильности комплекса рибосома-транскрипт,

- высокоэффективный синтетический промотор hEF-HTLV,

- нуклеотидную последовательность кДНК гена бета субъединицы тиротропина альфа человека (TSH beta),

- нуклеотидную последовательность участка внутренней посадки рибосомы (IRES), обеспечивающую инициацию трансляции кэп-независимую или внутреннюю инициацию трансляции в эукариотических клетках,

- нуклеотидную последовательность кДНК гена альфа субъединицы тиротропина альфа человека (TSH alpha),

- нуклеотидную последовательность удлиненного участка внутренней посадки рибосомы (IRESatt), обеспечивающую более низкий уровень внутренней инициации трансляции в эукариотических клетках,

- нуклеотидную последовательность кДНК гена дегидрофолатредуктазы человека (hDHFR), обеспечивающей жизнеспособность клеток линии CHO DG44 при росте на синтетических средах, не содержащих гипоксантин и тимидин, и находящуюся в единой рамке считывания с нуклеотидной последовательностью 39 С-концевых аминокислот орнитиндекарбоксилазы мыши (PEST), обеспечивающей быструю деградацию фьюжн-белка hDHFR-PEST.

2. Клеточную линию rhTSHCHO - высокопродуктивную стабильную линию-продуцент рекомбинантного тиреотропный гормона человека (тиротропина альфа), созданную путем трансформации линии CHO DG44 методом нуклеофекции рекомбинантной плазмидной ДНК pFUSE 1-68 MAR TSH, геном которой содержит экспрессионную плазмидную ДНК pFUSE 1-68 MAR TSH, кодирующую кДНК генов альфа и бета субъединиц рекомбинантного тиротропина альфа.

Изобретение иллюстрируют следующими примерами.

ПРИМЕР 1

Создание генетической конструкции pFUSE 1-68 MAR TSH SEQ ID NO: 1

Фрагмент ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность MAR1-68, получали методом ПЦР, с использованием в качестве матрицы геномную ДНК клеток НЕК293 и специфических олигонуклеотидов 5- aatacgatcgccctcttgcagatccctgaactgaggag и 5- aatacgatcggcccagtcttgtttctcttaaatcgtccaaacca. Полученный ПЦР-продукт был клонирован в плазмидную ДНК pFuse-hIgG1-Fc2 с использованием эндонуклеазы рестрикции PvuI с получением генетической конструкции pFuse-hIgG1-Fc2-1-68 MAR. Синтетически полученный фрагмент ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую кДНК генов альфа и бета субъединиц рекомбинантного тиротропина альфа и нуклеотидную последовательность, кодирующую фьюжн-белок hDHFR-PEST, клонировали в плазмидную ДНК pFuse-hIgG1-Fc2-1-68 MAR с использованием эндонуклеаз рестрикции SfoI и NheI с получением генетической конструкции pFUSE 1-68 MAR TSH (Рис. 1).

ПРИМЕР 2

Получение линии клеток CHO DG44 продуцента рекомбинантного тиротропина альфа человека

Генетической конструкция pFUSE 1-68 MAR TSH были трансформированы клетки CHO DG44 методом нуклеофекции, используя набор реагентов Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V (Lonza, Германия) на приборе Nucleofector 2b (Lonza, Германия). Для этого, согласно протоколу производителя, были поставлены 3 реакции нуклеофекции, содержащие 2, 5 и 10 мкг плазмидной ДНК pFUSE 1-68 MAR TSH и по 1 млн клеток DG44. Трансфецированные клетки объединяли в одну 125 мл колбу Эрленмейера (Corning, США), содержащую 30 мл прогретой до 37 °C базовой ростовой среды без добавления гипоксантина и тимидина (ProCHO5, 4 mM глутамин, 4 mM GlutaMAX) и культивировали на орбитальной качалке в инкубаторе (37 °C, 5% CO₂, влажность 95%, 125 оборотов/минуту). На 2-е сутки после трансфекции была отобрана проба культуральной жидкости для оценки продукции тиротропина методом ИФА. Продукция пула составила 0.070 пг/кл/день (0.04 мг/л культуры).

Для селекции самых продуктивных клеток и максимальной амплификации генетической кассеты конструкции pFUSE 1-68 MAR TSH в геноме CHO DG44 пул клеток после трансфекции пассировали по схеме, приведённой на Рис. 2. Для этого клетки пассировали в вышеупомянутой среде и условиях в течение 14 дней до восстановления жизнеспособности культуры более 90%. Пересев осуществляли каждые 3-6 дней центрифугированием культуры при 200g, отбором 90% супернатанта и добавлением равного объема свежей среды к оставшейся кондиционной среде с клетками в осадке. По прошествии этого времени жизнеспособность пула клеток составила 93%, продукция пула была 0.18 пг/кл/день (0.504 мг/л культуры).

Затем клетки пассировали вышеописанным способом в такую же среду, но теперь содержащую 250 нМ метотрексата (МТХ, Sigma-Aldrich). Метотрексат является ингибитором дегидрофолатредуктазы человека (hDHFR), что создает дополнительно метаболическое давление на клетки и приводит к накоплению всей генетической кассеты конструкции pFUSE 1-68 MAR TSH. Пассирование при данной концентрации метотрексата осуществляли в течение 45 дней, до достижения жизнеспособности 91%. Продукция пула составила 3.64 пг/кл/день (10.20 мг/л культуры).

Последним этапом клетки пассировали вышеописанным способом в среду, но содержащую 2500 нМ МТХ. Пассирование осуществляли в течение 54 дней, до достижения жизнеспособности 91%. Продукция пула составила 14.83 пг/кл/день (41.52 мг/л культуры).

Полученный высокопродуктивный пул клеток был расклонирован для получения гомогенной линии-продуцента, потомка одной клетки. Для этого клеточная культура была разбавлена до концентрации 3 клетки/мл в базовой среде с добавлением 10% кондиционной среды и раскапана по 100 мкл в лунки десяти 96-ти луночных культуральных планшетов. В тот же день на микроскопе в планшетах были найдены и отмечены лунки, содержащие строго одну клетку на лунку. В таком виде клетки растили в течение 10 дней, после чего содержимое выбранных ранее лунок с единичными клонами переносили для наращивания биомассы в 48-ми и затем в 12-ти луночный планшет. В течение это времени наблюдали относительную скорость роста клонов. Клоны с оптимальной скоростью роста и показателями жизнеспособности были отобраны для оценки продукции методом ИФА. Из 14-ти моноклонов по показателям продукции на клетку в планшете было выбрано 6 лучших для анализа экспрессии в колбах и для заморозки посевного пула клеток. Следующим этапом два лучших по продукции клона были отобраны для исследования стабильности продукции, для чего линии пассировали в течение трех недель и затем их снова использовали для наработки тиротропина. Линия с минимальным изменением показателей экспрессии была использована для получения главного банка клеток.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

dtdVersion="V1_3" fileName="Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая

последовательность белка тиротропина альфа, клеточная линия rhTSHCHO,

трансформированная плазмидной ДНК и секретирующая рекомбинантный

тиреотропный гормон человека.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.2.0" productionDate="2024-07-03">

<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">ИБХ РАН, ЭНЦ</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Shemyakin-Ovchinnikov Institute of bioorganic

chemistry, Endocrinology research center</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Рекомбинантная плазмидная ДНК,

кодирующая последовательность белка тиротропина альфа, клеточная

линия rhTSHCHO, трансформированная плазмидной ДНК и секретирующая

рекомбинантный тиреотропный гормон человека</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>1</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>9693</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..9693</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgccctcttgcagatccctgaactgaggaggcaagatcagtttggcagt

tgaagcagctggaatctgcaattcagagaatctaagaaaagacaaccctgaagagagagacccagaaacc

tagcaggagtttctccaaacattcaaggctgagggataaatgttacatgcacagggtgagcctccagagg

cttgtccattagcaactgctacagtttcattatctcagggatcacagattgtgctacctattgcctacca

tctgaaaacagttgcttcctatatttcatccagtttaatatttatttaaaccaagaaggttaatctggca

ccagctattccgttgtgagtggatgtgaaagtaccaattccattctgttttactattaactatcctttgc

cttaatatgtatcagtaggtggcttgttgctaggaaatattaaatgaatggcatgtttcataggttgtgt

ttaaagttgttttttgagttaaatctttctttaataatactttctgatgtcaaaaacacttagaagtcat

ggtgttgaacatctatatagggttggatctaaaatagcttcttaacctttcctaaccactgtttttgttt

gtttgtttttaactaagcatccagtttgggaaattctgaattaggggaatcataaaaggtttcattttag

ctgggccacataaggaaagtaagatatcaaattgtaaaaatcgttaagaacttctatcccatctgaagtg

tgggttaggtgcctcttctctgtgctcccttaacatcctattttatctgtatatatatatattcttccaa

atatccatgggaaaaaaaatctgatcataaaaatattttaggctgggagtggtggctcacgcctgtaatc

ccagcactttgggaggctgaggtgggcggatcatgaggtcaagagatcgagaccatcctgaccaatatgg

tgaaaccccatctctactaaagatacaaaactattagctggacgtggtggcacgtgcctgtagtcccagc

tactcgggaggctgaggcaggagaacggcttgaacccaggaggtggaggttgcagtgagctgagatcgcg

ccactgcactccagcctgggcgacagagcgagactctgtctcaaaaaaaaaatatatatatatatatata

tacacatatatatataaaatatatatatatacacacatatatatataaaatatatatatatacacacata

tatataaaatatatatatatacacacatatatataaaatatatatatacacacatatatataaaatatat

atatacacacatatatataaaatatatatatacacacatatatataaaatatatatatacacacatatat

ataaaatatatatatacacacatatatataaaatatatatatacacacatatatataaaatatatatata

cacacatatatataaaatatatatatacacacatatatataaaatatatatatacacacatatatataaa

atatatatatacacacatatataaaatatatatatacacacatatataaaatatatatatacacatatat

ataaaatatatatatacacatatatataaaatatatatacacacatatatataaaatatatatatacaca

catatatataaaatatatatatacacatatatataaaatatatatatacacatatatataaaatatatat

atatacacatatatataaaatatatatacacacatatatataaagtatatatatacacacatatatataa

aatatatatatacacatatatataaaatatatatatacacatatatataaaatatatatatacacatata

tataaaaatatatatatatattttttaaaatattccaattgtctcactttgtggatgagaaaaagaagta

gttagaggtcaagtaacttggcctacatcttttctcaagattgtaaactcctagtgagcaataaccacat

cttcattttctttgtataaaacaagaaagtttagcatgaaaaaggtactcaattacaaatgtgttggatt

gaattgaagacccttggaaggggattttgtacctgaggatctctttcttttggccatattgttcaatgga

caaaatttagccttcgaaggcaggccgatttgaggttaatactacctttaccacttgatagctatgtgac

cttggccatgtggtttcaacagtctgaacctcattttctctgtgtatgtgtggtcctccttacaagtttg

tgaaaaatgtgaagtccttagccatgatagcccaatataacaggctaaatgataataggtttatgttctt

ttcctttatattctcagataagcactgtccaagtttgaggtgttttgaggtctcgcctgatttggattgt

ttgagtttatgctattctttgaattctttgagctgttctgaagcagtgtatcatgaacaaaaacatcccc

agttcagtccaaacccctggttacatatcattcttatgccatgttataaccagtttgagagtgttccctc

tgttattgcatttaagtttcagcctcacacagaaattcagcagccaatttctaagccctaagcataaaat

ctggggtgggggggggggatggcctgaagagcagcattatgaatagcaccattataattaatgatctctc

aggaagatttacaatcacaggtagcagataaaacaaatagtactgcttctgcacttcccctccttttatt

cgctatgaaattttatgggaaatcagtccagtgaaaaatgtaagctcttaatctttcccagaaatcctac

ctcatttgatgaatactttgagggaatgaattagagcatttttttcttttatagtctacttcgcatttac

gaagtgaggacggtagcttaggctgcctggccaactgatgagaaggtcagaggcatttttagagacctct

gttgtctttcattcatgttcattttccacaaggcaagtaatttccaacaaatcagtgtcttcattagtaa

taagattattaacaacaataatagtcatagtaactattcagtgagagtccattatatatcaggcattcta

caaggtactttatatacatctgagtaaacctcacacaattctacagggaggtatttctatccccatttaa

caaataaggaaacgaagtccaagtaaattaacttgcccaaggtcacacagatagtacctggcagaacagg

aatttaaacctaaatttgtccaactccaaaagcagccttctatttgttataaatgctgcctctcattatc

acatattttattattaacaacaacaaacataccaattagcttaagatacaatacaaccagataatcatga

tgacaacagtaattgttatactattataataaaatagatgttttgtatgttactataatcttgaatttga

atagaaatttgcatttctgaaagcatgttcctgtcatctaatatgattctgtatctattaaaatagtact

acatctagagttctactactagatttatttatcactgagaatggtttggacgatttaagagaaacaagac

tgggccgatcgctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggg

gaggggtcggcaattgaacgggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgta

ctggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctt

tttcgcaacgggtttgccgccagaacacagctgaagcttcgaggggctcgcatctctccttcacgcgccc

gccgccctacctgaggccgccatccacgccggttgagtcgcgttctgccgcctcccgcctgtggtgcctc

ctgaactgcgtccgccgtctaggtaagtttaaagctcaggtcgagaccgggcctttgtccggcgctccct

tggagcctacctagactcagccggctctccacgctttgcctgaccctgcttgctcaactctacgtctttg

tttcgttttctgttctgcgccgttacagatccaagctgtgaccggcgcctacctgagatcaccggcgaag

gagggccaccatgactgctctctttctgatgtccatgctttttggccttgcatgtgggcaagcgatgtct

ttttgtattccaactgagtatacaatgcacatcgaaaggagagagtgtgcttattgcctaaccatcaaca

ccaccatctgtgctggatattgtatgacacgggatatcaatggcaaactgtttcttcccaaatatgctct

gtcccaggatgtttgcacatatagagacttcatctacaggactgtagaaataccaggatgcccactccat

gttgctccctatttttcctatcctgttgctttaagctgtaagtgtggcaagtgcaatactgactatagtg

actgcatacatgaagccatcaagacaaactactgtaccaaacctcagaagtcttatctggtaggattttc

tgtctaatagccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgttt

gtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtct

tcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaa

ggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaac

cccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcac

aaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaa

caaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgc

tttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttccttt

gaaaaacacgatgataatatggccacaaccatggattactacagaaaatatgcagctatctttctggtca

cattgtcggtgtttctgcatgttctccattccgctcctgatgtgcaggattgcccagaatgcacgctaca

ggaaaacccattcttctcccagccgggtgccccaatacttcagtgcatgggctgctgcttctctagagca

tatcccactccactaaggtccaagaagacgatgttggtccaaaagaacgtcacctcagagtccacttgct

gtgtagctaaatcatataacagggtcacagtaatggggggtttcaaagtggagaaccacacggcgtgcca

ctgcagtacttgttattatcacaaatcttaatagccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgc

ttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtga

gggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaat

gcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgta

gcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtat

aagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaa

atggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatct

gatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccga

accacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataagcttgccacaacccgggatcctctagagt

cgacatggttggttcgctaaactgcatcgtcgctgtgtcccagaacatgggcatcggcaagaacggggac

ctgccctggccaccgctcaggaatgaattcagatatttccagagaatgaccacaacctcttcagtagaag

gtaaacagaatctggtgattatgggtaagaagacctggttctccattcctgagaagaatcgacctttaaa

gggtagaattaatttagttctcagcagagaactcaaggaacctccacaaggagctcattttctttccaga

agtctagatgatgccttaaaacttactgaacaaccagaattagcaaataaagtagacatggtctggatag

ttggtggcagttctgtttataaggaagccatgaatcacccaggccatcttaaactatttgtgacaaggat

catgcaagactttgaaagtgacacgttttttccagaaattgatttggagaaatataaacttctgccagaa

tacccaggtgttctctctgatgtccaggaggagaaaggcattaagtacaaatttgaagtatatgagaaga

atgatcacggcttccctcccgaggtggaggagcaggccgccggcaccctgcccatgagctgcgcccagga

gagcggcatggatagacaccctgctgcttgcgccagcgccaggatcaacgtctaataggctagctggcca

gacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttattt

gtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaa

ttgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctac

aaatgtggtatggaattaattctaaaatacagcatagcaaaactttaacctccaaatcaagcctctactt

gaatccttttctgagggatgaataaggcataggcatcaggggctgttgccaatgtgcattagctgtttgc

agcctcaccttctttcatggagtttaagatatagtgtattttcccaaggtttgaactagctcttcatttc

tttatgttttaaatgcactgacctcccacattccctttttagtaaaatattcagaaataatttaaataca

tcattgcaatgaaaataaatgttttttattaggcagaatccagatgctcaaggcccttcataatatcccc

cagtttagtagttggacttagggaacaaaggaacctttaatagaaattggacagcaagaaagcgagcttc

tagcttatcctcagtcctgctcctctgccacaaagtgcacgcagttgccggccgggtcgcgcagggcgaa

ctcccgcccccacggctgctcgccgatctcggtcatggccggcccggaggcgtcccggaagttcgtggac

acgacctccgaccactcggcgtacagctcgtccaggccgcgcacccacacccaggccagggtgttgtccg

gcaccacctggtcctggaccgcgctgatgaacagggtcacgtcgtcccggaccacaccggcgaagtcgtc

ctccacgaagtcccgggagaacccgagccggtcggtccagaactcgaccgctccggcgacgtcgcgcgcg

gtgagcaccggaacggcactggtcaacttggccatgatggctcctcctgtcaggagaggaaagagaagaa

ggttagtacaattgctatagtgagttgtattatactatgcagatatactatgccaatgattaattgtcaa

actagggctgcagggttcatagtgccacttttcctgcactgccccatctcctgcccaccctttcccaggc

atagacagtcagtgacttaccaaactcacaggagggagaaggcagaagcttgagacagacccgcgggacc

gccgaactgcgaggggacgtggctagggcggcttcttttatggtgcgccggccctcggaggcagggcgct

cggggaggcctagcggccaatctgcggtggcaggaggcggggccgaaggccgtgcctgaccaatccggag

cacataggagtctcagccccccgccccaaagcaaggggaagtcacgcgcctgtagcgccagcgtgttgtg

aaatgggggcttgggggggttggggccctgactagtcaaaacaaactcccattgacgtcaatggggtgga

gacttggaaatccccgtgagtcaaaccgctatccacgcccattgatgtactgccaaaaccgcatcatcat

ggtaatagcgatgactaatacgtagatgtactgccaagtaggaaagtcccataaggtcatgtactgggca

taatgccaggcgggccatttaccgtcattgacgtcaatagggggcgtacttggcatatgatacacttgat

gtactgccaagtgggcagtttaccgtaaatactccacccattgacgtcaatggaaagtccctattggcgt

tactatgggaacatacgtcattattgacgtcaatgggcgggggtcgttgggcggtcagccaggcgggcca

tttaccgtaagttatgtaacgcctgcaggttaattaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag

gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaat

cgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagct

ccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaag

cgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggc

tgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacc

cggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtagg

cggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgc

gctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctg

gtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatccttt

gatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatggctagt

taattaacatttaaatcagcggccgcaataaaatatctttattttcattacatctgtgtgttggtttttt

gtgtgaatcgtaactaacatacgctctccatcaaaacaaaacgaaacaaaacaaactagcaaaataggct

gtccccagtgcaagtgcaggtgccagaacatttctctatcgaaggatctgcgat</INSDSeq_sequen

ce>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии. Предложены рекомбинантная плазмидная ДНК pFUSE 1-68 MAR TSH с SEQ ID NO: 1, кодирующая кДНК генов альфа и бета субъединиц рекомбинантного тиротропина альфа, и клеточная линия клеток яичника китайского хомячка rhTSHCHO, продуцирующая рекомбинантный тиротропин альфа человека и созданная путем трансформации линии CHO DG44 методом нуклеофекции вышеуказанной рекомбинантной плазмидной ДНК. Изобретение позволяет получить высокопродуктивную стабильную линию-продуцент рекомбинантного тиротропина альфа человека, а также синтезировать обе субъединицы тиротропина альфа, что уменьшает гетерогенность пула трансформированных клеток. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 2 пр.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pFUSE 1-68 MAR TSH SEQ ID NO: 1, кодирующая кДНК генов альфа и бета субъединиц рекомбинантного тиротропина альфа и содержащая нуклеотидную последовательность присоединения к ядерному матриксу MAR1-68, синтетический промотор hEF-HTLV, нуклеотидную последовательность кДНК гена бета субъединицы тиротропина альфа человека (TSH beta), нуклеотидную последовательность участка внутренней посадки рибосомы (IRES), нуклеотидную последовательность кДНК генов альфа субъединицы тиротропина альфа человека (TSH alpha), нуклеотидную последовательность удлиненного участка внутренней посадки рибосомы, нуклеотидную последовательность кДНК гена дегидрофолатредуктазы человека (hDHFR), находящуюся в единой рамке считывания с нуклеотидной последовательностью 39 С-концевых аминокислот орнитиндекарбоксилазы мыши.

2. Клеточная линия клеток яичника китайского хомячка rhTSHCHO - продуцент рекомбинантного тиротропина альфа человека, созданная путем трансформации линии CHO DG44 методом нуклеофекции рекомбинантной плазмидной ДНК pFUSE 1-68 MAR TSH по п.1.