Способ получения питательной среды жидкой обогащенной для культивирования лептоспир Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 C12N1/38 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, а именно, к получению питательных сред жидких для культивирования лептоспир.

При бактериологическом исследовании на лептоспироз и для накопления бактериальной массы лептоспир используют твин-альбуминовую среду. Среду готовят поэтапно. Основные растворы получают, растворяя следующие ингредиенты (в 100,0 мл дистиллированной воды каждый): NH₄Cl-25,0 г, ZnSO₄⋅7H₂O-0,4 г, MgCl₂⋅6H₂O и СаС1₂⋅2H₂O - по 1,5 г каждый, FeSO₄⋅7H₂O-0,5 г, пируват натрия - 10,0 г, глицерин - 10,0 г, Твин-80 - 10,0 г, тиамин - 0,5 г и цианкобаламин - 0,02 г. Раствор FeSO₄ должен быть свежеприготовленным и прозрачным. Приготовление альбуминовой добавки: 10,0 г бычьего сывороточного альбумина (V фракция) растворяют в 50,0 мл дистиллированной воды, размешивают на магнитной мешалке, добавляя следующие растворы: СаС1₂ или MgCl₂-1,0 мл; FeSO₄-10,0 мл; цианкобаламин - 1,0 мл; Твин-80 - 12,5 мл. рН доводят до 7,4 и добавляют дистиллированную воду до конечного объема 100,0 мл. Альбуминовую добавку стерилизуют фильтрацией. Готовят основу среды: к 996 мл дистиллированной воды добавляют: Na₂HPO₄ (обезвоженный) - 1 г; K₂HPO₄ (обезвоженный) - 0,3 г и NaCl-1,0 г. Затем добавляют следующие растворы: NH₄Cl - 1,0 мл; тиамин - 1,0 мл; пируват натрия - 1,0 мл и глицерин - 1,0 мл. рН основы среды доводят до 7,4, а затем стерилизуют автоклавированием при 120°С в течение 20 мин. Приготовление жидкой твин-альбуминовой среды: 1 объем альбуминовой добавки смешивают с 9 объемами основы среды при соблюдении асептики.

Недостатки данной среды - многокомпонентность, длительность и сложность изготовления.

Наиболее близкой к предполагаемому изобретению является питательная среда Ферворта-Вольфа в модификации С.И. Тарасова. Состав среды: дистиллированной воды - 900 мл, натрия хлористого -0,5 г, пептона (Дифко или Витте) - 1 г, маточного раствора фосфатного буфера с рН 7,2 - 100 мл. Смесь в колбе автоклавируют при 120°С 30 мин. На следующий день ее дважды фильтруют через двухслойный бумажный фильтр, разливают в пробирки по 5 мл и снова автоклавируют при 120°С 30 мин. В пробирки с прозрачной средой добавляют по 0,5 мл инактивированной (при 56°С в течение 30 мин на водяной бане) кроличьей сыворотки. Среду дважды прогревают на водяной бане при температуре 56-58°С по 30 мин. Для проверки на стерильность пробирки со средой выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 3-5 сут.

К недостаткам данной среды относятся длительность, многоэтапность изготовления, а также быстрая истощаемость, которая приводит к ослаблению и гибели диагностических штаммов, требующих длительного сохранения.

Целью изобретения является разработка питательной среды жидкой обогащенной для культивирования лептоспир с высокими ростовыми свойствами в отношении возбудителей лептоспирозов и простой методикой изготовления.

Сущность предполагаемого изобретения состоит в том, что обогащение состава питательной среды полисорбатом Твин-80 и тиамином оказывает благоприятное сочетанное влияние на скорость роста, количество и стабильность формируемых на ней клеток лептоспир, при этом замена кроличьей сыворотки, инактивированной при температуре 56°С в течение 30 мин на водяной бане, на готовый коммерческий препарат - сыворотку лошадиную нормальную для бактериологических питательных сред жидкую позволяет упростить и сократить процесс изготовления среды благодаря исключению этапа ее двукратного прогревания на водяной бане после добавления сыворотки. Кроме того, нет необходимости повторного автоклавирования при 120°С в течение 30 мин после розлива среды в пробирки, что также упрощает методику изготовления предлагаемой среды.

Технический результат достигается тем, что в состав питательной среды жидкой включены: сыворотка лошадиная нормальная для бактериологических питательных сред жидкая - в качестве основного источника азота; пептон ферментативный сухой и тиамин - в качестве дополнительных питательных факторов; полисорбат Твин-80 - как источник жирных кислот, для интенсификации роста лептоспир; рабочий раствор, содержащий фосфаты натрия и калия - для обеспечения буферности среды; натрий хлористый - для поддержания уровня осмотического давления в среде, дистиллированная вода - в качестве растворителя, при следующем соотношении ингредиентов, на 1 л:

Твин-80 12,5 мл Сыворотка лошадиная нормальная для бактериологических питательных сред жидкая 10,0 мл Пептон ферментативный сухой 1,0 г Тиамин 0,005 Натрий хлористый 0,5 г Рабочий раствор фосфатно-буферной смеси в дистиллированной воде до 1 л

Получение рабочего раствора фосфатно-буферной смеси. Готовят два исходных 1/15-М маточных раствора: в 1 л дистиллированной воды растворяют 11,867 г двузамещенного фосфорнокислого натрия; в 1 л дистиллированной воды растворяют 9,067 г однозамещенного фосфорнокислого калия. Растворы хранят при 2-4°С до 1 мес. Для получения рабочего буферного раствора (рН 7,2) смешивают 72 мл 1/15-молярного раствора двузамещенного фосфорнокислого натрия (щелочной раствор) и 28 мл 1/15-М раствора однозамещенного фосфорнокислого калия (кислый раствор). К полученным 100 мл фосфатного буфера добавляют 900 мл дистиллированной воды. При отклонении рН в кислую или щелочную сторону, соответственно, добавляют раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия или однозамещенного фосфорнокислого калия. Основу дважды фильтруют через двуслойный бумажный фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 20 мин. После автоклавирования флаконы с помутневшим или давшим осадок раствором выбраковываются. Срок хранения рабочего раствора 1 мес при температуре 2-4°С[1].

Твин-80 - оксиэтилированный сложный моноэфир ангидрогексавитов жирных кислот, химическая формула - С₆₄Н₂₆О₁₂₄. Представляет собой прозрачную, маслянистую, слегка вязкую жидкость от желтого, ярко-янтарного, до коричневого цвета с легким характерным запахом, растворимую в воде и маслах растительного и животного происхождения. Добавление небольших количеств Твин-80 к эфирным и жирным маслам придает им способность легко растворяться в воде, при сохранении всех полезных свойств масел в смеси. Также хорошо растворяется в изопропиловом и этиловом спирте, бензоле. В минеральных маслах не растворяется. Получают химическим способом из сорбита и жирных кислот оливкового масла. Применяется для бактериологических исследований, используется в качестве компонента обогащения питательных сред, для поддержания жизнеспособности микроорганизмов, а также для нейтрализации дезинфектантов в санитарных образцах [2].

Пептон ферментативный сухой для бактериологических целей (ГОСТ 13805-76), или панкреатический перевар, получают за счет ферментов поджелудочной железы. Пептон выпускают, главным образом, в сухом состоянии, в виде желто-бежевого порошка. Пептон характеризуется высокой питательной ценностью для микроорганизмов [3].

Тиамин (витамин B₁) является фактором роста, в котором возбудители лептоспироза испытывают потребность [1]. Многие бактерии лишены способности синтезировать все необходимые для роста органические соединения, и зависят от наличия в среде определенных факторов роста. Потребность в витаминах является общим свойством всех микроорганизмов.

Натрий хлористый необходим для поддержания изотоничности среды. Растворенные в питательной среде и находящиеся в состоянии электролитического распада, ионизируемые минеральные соединения являются одновременно катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке. Ионы натрия (Na⁺) участвуют в транспорте веществ через клеточные мембраны и в регуляции синтеза белка [4].

Сыворотка лошадиная нормальная для бактериологических питательных сред жидкая - коммерческий препарат, является основным источником азота в питательной среде жидкой, обеспечивает формирование полноценных, активно подвижных микробных клеток лептоспир.

Подготовка посуды

Предназначенную для культивирования лептоспир посуду необходимо подвергать специальной обработке, дезинфицировать и мыть отдельно от другой. В настоящей работе пользовались пробирками, обработанными по специальной методике [1], включающей следующие этапы:

- погружение на 24 ч в 1-2% раствор соляной кислоты в стеклянной или в эмалированной посуде;

- промывание проточной водопроводной водой (12 - 15 раз);

- обработку ершами в горячем мыльном растворе (1 кусок хозяйственного мыла на 10 л воды);

- тщательное промывание проточной водопроводной водой (12-15 раз);

- погружение в дистиллированную воду на 24 ч;

- сушку и стерилизацию вместе с ватными пробками.

Новые резиновые шланги и пробки промывали проточной водопроводной водой, кипятили в течение 30-40 мин в 2% растворе пищевой соды, промывали водопроводной водой и снова кипятили в дистиллированной воде 30-45 мин, после чего просушивали.

Изготовление питательной среды

Для изготовления питательной среды жидкой обогащенной для культивирования лептоспир на весах взвешивали натрий хлористый - 0,5 г; пептон ферментативный сухой - 1,0 г; тиамин - 0,005 г. Навески ссыпали в эмалированную емкость, добавляли 12,5 мл Твин-80 и до 1,0 л доливали готовый рабочий раствор фосфатно-буферной смеси в дистиллированной воде. Кипятили 1-2 мин до полного растворения всех ингредиентов. Измеряли рН среды, он должен быть в пределах 7,4±0,2, и разливали по 333 мл в градуированные флаконы объемом 450 мл, после чего завальцовывали и стерилизовали при температуре 115°С в течение 15 мин. Остужали до температуры 56°С, затем в каждый флакон над факелом спиртовки вносили стерильной бактериологической пипеткой по 3,3 мл сыворотки лошадиной нормальной для бактериологических питательных сред жидкой (из расчета 10 мл/л), и разливали стерильными бактериологическими пипетками в стерильные бактериологические пробирки высокой степени чистоты по 5 мл среды. Количество полисорбата Твин-80 и сыворотки лошадиной нормальной для бактериологических питательных сред жидкой, добавляемое из расчета на 1 л среды, в приведенных примерах от первого к третьему увеличивали на 2,5 мл для Твин-80 и на 5 мл для сыворотки, начиная с доз 10 мл и 5 мл, соответственно.

Оценка ростовых свойств предлагаемой питательной среды жидкой обогащенной для культивирования лептоспир

Для контроля стерильности среду выдерживали при температуре 37°С в течение 2 сут и до 7 сут - при комнатной температуре (20-25°С), среда должна оставаться прозрачной.

Ростовые свойства оценивали в соответствии с методическими указаниями МУ 3.1.1128-02 Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний людей лептоспирозами [5] и с учетом требований СанПиН 3.3686-21 Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней [6], используя культуры диагностических вирулентных штаммов Leptospira interrogans П.O.5621 (серогруппа Pomona); штамм М20 (серогруппа Icterohaemorrhagiae); штамм Перепелицин (серогруппа Tarassovi); штамм Ballico (серогруппа Australis); штамм Akiyami А (серогруппа Autumnalis), ослабленные многократным пассированием на питательной среде Ферворта-Вольфа в модификации СИ. Тарасова. Эту же среду применяли в экспериментах для сравнения ростовых свойств.

Посевы на обе среды производили параллельно по 0,5 мл на каждую пробирку из исходных пробирок с хранящимися культурами, после чего помещали в термостат при температуре 29±1°С Рост лептоспир в предлагаемой и взятой для сравнения питательных средах наблюдался в виде едва заметного помутнения. Так как данные возбудители плохо воспринимают окраску, бактериоскопические исследования с лептоспирами проводят в темном поле микроскопа, готовя препарат «раздавленная капля».

Для обнаружения роста лептоспир с 5 по 14 сут культивирования штаммов готовили препараты «раздавленной капли», петлей нанося капли по 5 мкл из пробирок на предметные стекла толщиной не более 1,0-1,1 мм и накрывая покровным стеклом толщиной 0,2 мм. Живых возбудителей наблюдали при помощи микроскопа с конденсором темного поля и, в связи с достаточно крупным размером микроба, - сухих систем: объектива ×40 и окуляра ×10. Препараты исследовали путем просмотра 10 полей зрения при увеличении ×400. Учитывали наличие тонких, гибких, подвижных серебристых нитей с загнутыми в виде крючков концами, активность микробов, количество их в поле зрения.

Представлена таблица с данными о количестве клеток лептоспир, наблюдаемых в препаратах «раздавленной капли» со среды сравнения и предлагаемой питательной среды.

В препаратах «раздавленной капли» из посевов со среды сравнения через 5 сут культивирования диагностических штаммов L. interrogans наблюдали, в среднем, 63±0,6 клеток лептоспир типичной морфологии: от 62±1,7 м.к. (у штамма Перепелицин (серогруппа Tarassovi) до 65±2,3 м.к. (у штамма Akiyami А серогруппа Autumnalis).

На 14 сут после посева повторный просмотр показал незначительное снижение числа микробных клеток в поле зрения для всех тестируемых штаммов.

Пример 1. Испытуемые штаммы выращивали на питательной среде жидкой обогащенной для культивирования лептоспир при оптимальном рН 7,4±0,2, содержащей, г/л: натрия хлористого - 0,5 г; пептона ферментативного сухого - 1,0 г; тиамина - 0,005 г; полисорбата Твин-80 - 10,0 мл; сыворотки лошадиной нормальной для бактериологических питательных сред жидкой -5 мл, готового рабочего раствора фосфатно-буферной смеси в дистиллированной воде - до 1,0 л. Сухие навески помещали в эмалированную емкость, добавляли Твин-80 и рабочий раствор фосфатно-буферной смеси в дистиллированной воде. Кипятили 1-2 мин до полного растворения всех ингредиентов. Измеряли рН, убеждались, что он находится в пределах 7,4±0,2, и разливали среду по 333 мл в градуированные флаконы объемом 450 мл, после чего завальцовывали и стерилизовали при температуре 115°С в течение 15 мин. Остужали до температуры 56°С, в каждый флакон над факелом спиртовки вносили стерильной бактериологической пипеткой по 1,67 мл сыворотки лошадиной нормальной для бактериологических питательных сред жидкой, и разливали стерильными бактериологическими пипетками в стерильные бактериологические пробирки высокой степени чистоты по 5 мл среды. Выдерживали среду при температуре 37°С в течение 2 сут и при комнатной температуре (20-25°С) в течение 7 сут для контроля стерильности, после чего производили посев культур по 0,5 мл на каждую пробирку и культивировали при температуре 29±1°С.

При таком соотношении ингредиентов в питательной среде жидкой обогащенной для культивирования лептоспир в препаратах «раздавленной капли» из посевов, выдержанных в термостате в течение 5 сут при температуре 29±1°С, в темном поле зрения при увеличении ×400 наблюдалось, в среднем, 41±0,4 типичных, активно подвижных клеток лептоспир: от 41±1,7 м.к. штамма Ballico (серогруппа Australis) до 43±1,0 м.к. штамма П.О.5621 (серогруппа Pomona). При повторном просмотре через 14 сут после посева количество микробных клеток и их морфология существенно не менялись.

Пример 2. Испытуемые штаммы выращивали на питательной среде жидкой обогащенной для культивирования лептоспир при оптимальном рН 7,4±0,2, содержащей, г/л: натрия хлористого - 0,5 г; пептона ферментативного сухого - 1,0 г; тиамина - 0,005 г; полисорбата Твин-80 - 12,5 мл; сыворотки лошадиной нормальной для бактериологических питательных сред жидкой -10 мл; готового рабочего раствора фосфатно-буферной смеси в дистиллированной воде - до 1,0 л. Сухие навески помещали в эмалированную емкость, добавляли Твин-80 и рабочий раствор фосфатно-буферной смеси в дистиллированной воде. Кипятили 1-2 мин до полного растворения всех ингредиентов. Измеряли рН, убеждались, что он находится в пределах 7,4±0,2, и разливали среду по 333 мл в градуированные флаконы объемом 450 мл, после чего завальцовывали и стерилизовали при температуре 115°С в течение 15 мин. Остужали до температуры 56°С, в каждый флакон над факелом спиртовки вносили стерильной бактериологической пипеткой по 3,3 мл сыворотки лошадиной нормальной для бактериологических питательных сред жидкой, и разливали стерильными бактериологическими пипетками в стерильные бактериологические пробирки высокой степени чистоты по 5 мл среды. Выдерживали среду при температуре 37°С в течение 2 сут и при комнатной температуре (20-25°С) в течение 7 сут для контроля стерильности, после чего производили посев культур по 0,5 мл на каждую пробирку и культивировали при температуре 29±1°С.

При таком соотношении ингредиентов в питательной среде жидкой обогащенной для культивирования лептоспир в препаратах «раздавленной капли» из посевов, выдержанных в термостате в течение 5 сут при температуре 29±1°С, в темном поле зрения при увеличении ×400 наблюдалось, в среднем, 121±4,0 активно подвижных клеток лептоспир с типичными морфологическими признаками: от 111±3,3 м.к. штамма М20 (серогруппа Icterohaemorrhagiae) до 130±4,1 м.к. штамма Akiyami А (серогруппа Autumnalis). На 14 сут количество типичных и подвижных клеток сохранялось.

Пример 3. Испытуемые штаммы выращивали на питательной среде жидкой обогащенной для культивирования лептоспир при оптимальном рН 7,4±0,2, содержащей, г/л: натрия хлористого - 0,5 г; пептона ферментативного сухого - 1,0 г; тиамина - 0,005 г; полисорбата Твин-80 - 15,0 мл; сыворотки лошадиной нормальной для бактериологических питательных сред жидкой -15 мл; готового рабочего раствора фосфатно-буферной смеси в дистиллированной воде - до 1,0 л. Сухие навески помещали в эмалированную емкость, добавляли Твин-80 и рабочий раствор фосфатно-буферной смеси в дистиллированной воде. Кипятили 1-2 мин до полного растворения всех ингредиентов. Измеряли рН, убеждались, что он находится в пределах 7,4±0,2, и разливали среду по 333 мл в градуированные флаконы объемом 450 мл, после чего завальцовывали и стерилизовали при температуре 115°С в течение 15 мин. Остужали до температуры 56°С, в каждый флакон над факелом спиртовки вносили стерильной бактериологической пипеткой по 5,0 мл сыворотки лошадиной нормальной для бактериологических питательных сред жидкой, и разливали стерильными бактериологическими пипетками в стерильные бактериологические пробирки высокой степени чистоты по 5 мл среды. Выдерживали среду при температуре 37°С в течение 2 сут и при комнатной температуре (20-25°С) в течение 7 сут для контроля стерильности, после чего производили посев культур по 0,5 мл на каждую пробирку и культивировали при температуре 29±1°С.

При таком соотношении ингредиентов в питательной среде жидкой обогащенной для культивирования лептоспир в препаратах «раздавленной капли» из посевов, выдержанных в термостате в течение 5 сут при температуре 29±1°С, в темном поле зрения при увеличении ×400 наблюдалось, в среднем, 161±1,6 клеток лептоспир: от 156±1,1 м.к. штамма М20 (серогруппа Icterohaemorrhagiae) до 164±3,7 м.к. штамма Akiyami А (серогруппа Autumnalis), однако подсчет клеток был затруднен из-за спонтанной агглютинации, наблюдавшейся у всех испытуемых штаммов. При просмотре через 14 сут культивирования во всех пробирках наблюдалось некоторое снижение числа лептоспир: их количество, в среднем, составило 154±1,2 м.к.: от 151±1,1 м.к. штамма М20 (серогруппа Icterohaemorrhagiae) до 157±1,8 м.к. штамма Перепелицин (серогруппа Tarassovi).

Таким образом, заявленная питательная среда жидкая обогащенная для культивирования лептоспир, изготовленная по методике, описанной в примере 2, является оптимальной по количеству полученных клеток лептоспир, обладающих типичными морфологическими признаками и активной подвижностью, наблюдаемых в препаратах «раздавленной капли» в темном поле зрения микроскопа при увеличении ×400.

Предлагаемая питательная среда готовится по упрощенной методике и обладает высокими ростовыми свойствами, позволяющими восстанавливать жизнеспособность ослабленных многократными пассажами культур, что имеет существенное значение для сохранения диагностических штаммов возбудителей лептоспирозов.

Список использованной литературы

1. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство / Под редакцией академика РАМН Г.Г. Онищенко и академика В.В. Кутырева. Изд. 2-е, переработанное и дополненное. -Москва.: ЗАО «Шико», 2013. - С. 468-498.

2. Партанен Л., Марттинен Н. и Алатоссава Т. (2001). Жиры и жирные кислоты как факторы роста Lactobacillus delbrueckii. System. Appl. Микробиол. 24, 500-506. doi: 10.1078/0723-2020-00078.

3. Поляк M.C., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. - СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2008. -352 с.

4. Меджидов М.М. Справочник по микробиологическим питательным средам. М., «Медицина», 2003. - С.18.

5. МУ 3.1.1128-02 Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний людей лептоспирозами. - Минздрав России, - Москва. - 2002.

6. Санитарные правила и нормы СанПиН 3.3686-21 Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней. - Москва, МЗ РФ. - 2021.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения питательной среды жидкой обогащенной для культивирования лептоспир, включающий смешивание компонентов: натрий хлористый - 0,5 г; пептон ферментативный сухой - 1,0 г; тиамин - 0,005 г в емкости, в смесь добавляют 12,5 мл Твин-80 и доливают готовым рабочим раствором фосфатно-буферной смеси в дистиллированной воде до 1,0 л, кипятят до полного растворения всех ингредиентов, рН среды составляет 7,4±0,2, и разливают в градуированные флаконы, после чего завальцовывают и стерилизуют при температуре 115°С в течение 15 мин, остужают до температуры 56°С, затем в каждый флакон стерильной бактериологической пипеткой вносят сыворотку лошадиную нормальную для бактериологических питательных сред жидкую из расчета 10 мл/л и разливают среду в стерильные бактериологические пробирки. Изобретение позволяет разработать питательную среду жидкую обогащенную для культивирования лептоспир с высокими ростовыми свойствами в отношении возбудителей лептоспирозов и простой методикой изготовления. 1 табл., 3 пр.

Способ получения питательной среды жидкой обогащенной для культивирования лептоспир, включающий смешивание компонентов: натрий хлористый - 0,5 г; пептон ферментативный сухой - 1,0 г; тиамин - 0,005 г в емкости, в смесь добавляют 12,5 мл Твин-80 и доливают готовым рабочим раствором фосфатно-буферной смеси в дистиллированной воде до 1,0 л, кипятят до полного растворения всех ингредиентов, рН среды составляет 7,4±0,2, и разливают в градуированные флаконы, после чего завальцовывают и стерилизуют при температуре 115°С в течение 15 мин, остужают до температуры 56°С, затем в каждый флакон стерильной бактериологической пипеткой вносят сыворотку лошадиную нормальную для бактериологических питательных сред жидкую из расчета 10 мл/л и разливают среду в стерильные бактериологические пробирки.