ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ЖИДКАЯ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ И СБРОСА БИОМАССЫ ВАКЦИОННОГО ШТАММА ЧУМНОГО МИКРОБА YERSINIA PESTIS EV Российский патент 2021 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к микробиологии, именно к приготовлению микробиологических питательных сред жидких для выращивания и сбора биомассы вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV и может быть использовано в получении питательной среды, обеспечивающей высокий процент живых микробных клеток.

Качество питательной среды во многом зависит от используемых в приготовлении ингредиентов. Наряду с распространенными средами Хоттингера на основе гидролизата говяжьего мяса, для приготовления питательных сред используют различное сырье растительного и животного происхождения, в том числе на основе ферментативного гидролизата казеина. При получении накопительных сред в качестве ростостимулирующих добавок для вакцинного штамма чумного микроба традиционно используется натрий сернистокислый. Однако в литературе встречается упоминание и других стимуляторов роста (Терентьева, Л.И., Аптасарова Р.А., Орел Л.Л. Молибденово-кислый аммоний как фактор повышения чувствительности жидких питательных сред для диагностики чумного микроба. Современные аспекты эпиднадзора за особо опасными инфекциями: Тезисы. XIII конф. Противочумных. Учреждений. Средней Азии и Казахстана, Алма-Ата, 1990, 91-93). Сочетание гидролизата казеина как основы с добавлением молибденовокислого аммония в качестве ростостимулирующей добавки позволит получить новую накопительную среду для выращивания биомассы вакцинного штамма чумного микроба.

Известна питательная среда жидкая для культивирования вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV, основой которой является ферментативный гидролизат говяжьего мяса 170,0-190,0 мл; натрий хлористый 3,0-5,0 г; натрий сернистокислый 3,0-5,0 г; натрий фосфорнокислый 3,0-5,0 г; стимулятор Карпузиди 0,006-0,010 мл; очищенная вода. (Регламент производства №702-97. Вакцина чумная живая сухая. 2002 г., 260 с.). (Патент RU №2433170. "Питательная среда жидкая для культивирования чумного микроба вакцинного штамма ЕВ" Опубл. 10.11.2011 Бюлл. №31).

Недостатком данной среды является ее низкая продуктивность.

Наиболее близкой к заявляемому изобретению является питательная среда (жидкая) для культивирования чумного микроба вакцинного штамма Yersinia pestis EV, содержащая г/л: ферментативный гидролизат бобов сои 320,0-420,0 г; натрий хлористый 4,0-6,0 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный 3,0-5,0 г; натрий сернистокислый 0,3-0,5 г; липоевая кислота 0,4-0,6 г; 20% раствор натрия гидроокиси 2,5-3,5 мл; дистиллированная вода до 1 л. (Патент RU №2260620 С1, Опубл. 20.09.2005. Бюлл. №26.).

Недостатком данной среды является сложность ее приготовления.

Целью изобретения стало получение питательной среды жидкой для выращивания биомассы вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV, обеспечивающей достаточный сбор биомассы с высоким процентом живых микробных клеток через 48 ч.

Технический результат изобретения заключается в том, что в состав питательной среды в качестве питательной основы и источника азота входит панкреатический гидролизат казеина, пептон сухой ферментативный, а также натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный, дистиллированная вода и аммоний молибденовокислый 4-х водный в качестве ростостимулирующей добавки.

В результате получают достаточное количество биомассы вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV с высоким процентом живых микробных клеток через 48 ч на питательной среде жидкой, содержащей следующие ингредиенты:

Панкреатический гидролизат казеина 89,0 мл Пептон сухой ферментативный 20,0 г Натрий хлористый 5,0 г Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 4,0 г Аммоний молибденовокислый 4-х водный 0,5 г Дистиллированная вода до 1 л

Казеин ГОСТ 31689-2012, «Ленреактив», г. Санкт-Петербург. Белок из группы фосфопротеидов, составляет до 85% общего количества белка молока. Небелковым компонентом казеина является фосфорная кислота, связанная с серином. Элементарный состав казеина (в %): углерод - 53,1; водород - 7,1; кислород - 22,8; азот - 15,4; сера - 0,8; фосфор - 0,8. Высушенный казеин - белый порошок без вкуса и запаха, практически не растворим в воде и органических растворителях, растворяется в водных растворах солей и разбавленных щелочей, из которых выпадает в осадок при подкислении. Казеин хорошо переваривается протеазами, содержит все необходимые аминокислоты (в том числе незаменимые) (Химическая энциклопедия Издательство "Советская энциклопедия" Москва. 1990. Τ 2. С.284).

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей ТУ 9385-060-39484474-2009, «НИЦФ», г. Санкт-Петербург. Пептон представляет собой смесь разнообразных частиц распада белка, не свертывающихся при нагревании (пептоны, пептиды аминокислоты и т.д.). Пептон ферментативный в своем составе содержит 16 аминокислот (мг%): аспарагиновая кислота 0,40±0,03; треонин 0,30±0,01; серии 0,40±0,03; глутаминовая кислота 0,50±0,03; глицин 0,50±0,01; аланин 1,0±0,02; валин 0,80±0,02; метионин 0,40±0,02; изолейцин 0,70±0,01; лейцин 2,40±0,06; тирозин 0,40±0,01; фенилаланин 1,30±0,01; лизин 1,30±0,05; гистидин 0,32±0,02; триптофан 0,06±0,01 (Шепелин А.П., Дятлов И.А. Питательные среды для энтеробактерий. Оболенск 2017. С-41-43).

Натрий хлористый (хч) ГОСТ 4233-77, «ООО Хлорен Хима», г. Барнаул. Бактерии нуждаются в минимальном количестве солей. Будучи растворены в питательной среде и находясь в состоянии электролитического распада, ионизируемые минеральные соединения являются одновременно катализаторами различных химических процессов.

Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный (чда) ГОСТ 4172-76, АО «РЕАТЭКС». Включение в состав среды натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного обосновано его буферным действием в физиологическом диапазоне рН (М.С.Поляк; В.И. Сухаревич; М.Э. Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СП6. - 2008. - С.37-38).

Аммоний молибденовокислый 4-х водный (NH₄)₆Мо₇О₂₄•4Н₂О (хч) ГОСТ 3765-78, ООО «СПЛАВ», г. Калуга. Соль аммония обеспечивает раскрытие пептидных связей белковых молекул, которые становятся более доступными для роста различных микроорганизмов.

Дистиллированная вода ГОСТ 6709-72, ФКУЗ Ставропольский противочумный институт. Внешний вид - прозрачная жидкость, хлориды, мг/дм³ - нет, нитраты, мг/дм³ - нет. Удельная электропроводимость при 20°С, см/м - 0,38, рН 6,5. Вода составляет 80-90% от клеточной массы микроорганизмов и играет важнейшую роль в их физиологических функциях, входит состав структурных элементов клетки, служит средой для биохимических реакций, источником кислорода в процессах метаболизма, непосредственно участвует в метаболических реакциях.

Приготовление панкреатического гидролизата казеина

Казеин замачивают в холодной воде из расчета 1 кг сухого казеина на 12,5 л питьевой воды. Через 24 ч воду сливают, казеин отжимают. Рассчитывают необходимое количество питьевой воды для доведения раствора до объема 12,5 л. Воду кипятят, устанавливают рН 8,05±1,0 раствором 20% натрия гидроокиси. В кипящую воду опускают размоченный казеин и кипятят, поддерживая рН 7,9-8,0 добавлением 20% раствора натрия гидроокиси. Кипячение продолжают до тех пор, пока казеин не растворится и масса не станет однородной, при этом рН не меняется в течение 15 мин. Проверяют объем, при необходимости доливают горячей дистиллированной водой до первоначального и корректируют рН. Смесь охлаждают до 45°С, вносят эмульсию поджелудочной железы из расчета 100,0 г на литр. Добавляют хлороформ до конечной концентрации 2%. Гидролиз проводят в бутылях, которые закрывают 5-6 слоями пергамента в и закрепляют резиновыми кольцами, при температуре 45-48°С в течение 7-8 сут. В первые 6-8 ч смесь перемешивают каждые 15 мин по 5 мин, в последующем - каждые 2 ч по 5 мин. Ежедневно измеряют уровень аминного азота. С прекращением нарастания аминного азота (на 7-8 сут) прекращают перемешивание и подогрев. Дают отстояться в течение 2 суток, затем отфильтровывают через полотно Бельтинг от осадка, разливают по бутылям с добавлением 1% хлороформа от объема, пробкуют стерильными резиновыми пробками и хранят при температуре 4-6°С.

Подготовка панкреатического гидролизата для приготовления питательной среды жидкой

Панкреатический гидролизат казеина отфильтровывают от осадка, определяют аминный азот. По содержанию аминного азота рассчитывают количество гидролизата, необходимое для приготовления питательной среды жидкой. Основной раствор разводят дистиллированной водой в пропорции 1:1 и доводят до кипения. Добавляют 2% активированного угля марки ОУ-А, кипятят при помешивании 10 мин, затем фильтруют через вату, а затем через полотно Бельтинг. Разбавляют дистиллированной водой до необходимого содержания аминного азота. Добавляют натрий хлористый до 0,5%, кипятят 30 мин. В готовом бульоне определяют рН и устанавливают его 7,2±0,1, затем фильтруют через полотно или 18 слоев фильтровальной бумаги.

Приготовление питательной среды жидкой

Питательную среду на основе панкреатического гидролизата казеина для культивирования и сбора биомассы вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV готовят из следующих ингредиентов: панкреатический гидролизат казеина (содержание аминного азота 0,12%) - 89,0 мл; пептон сухой ферментативный - 20,0 г; натрий хлористый - 5,0 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 4,0 г; вода дистиллированная - до 1 л. Среду кипятят до полого растворения ингредиентов, устанавливают рН 7,2±0,1 с помощью 20% раствора натрия гидроокиси, фильтруют через 18 слоев фильтровальной бумаги. Добавляют 0,5 г аммония молибденовокислого 4-х водного, интенсивно перемешивают, расфасовывают, стерилизуют при (106±1)°С, 1 атм. в течение 20 мин.

В качестве контроля используют питательную среду жидкую - бульон Хоттингера рН 7,2±0,1 приготовленную по ПР 01897080-09-16.

Разработка технологии и создание питательной среды жидкой, которая может служить основой для накопления биомассы в биотехнологии глубинного культивирования вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV при производстве вакцины чумной живой, лиофилизата для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций. Питательный бульон должен содержать в достаточном количестве источники углерода, азота, неорганические соли, ростовые факторы, иметь оптимальные концентрации водородных ионов и окислительно-восстановительный потенциал, быть прозрачным для визуальной оценки результатов при росте микроорганизма.

Ампулу с сухой культурой вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV вскрывают с соблюдением правил асептики, восстанавливают ее содержимое 0,9% раствором натрия хлорида и засевают микробной взвесью ряд пробирок со скошенным агаром Хоттингера рН7,1±0,1 (исходная культура или культура I генерации). Одновременно контролируют ее культурально-морфологические и ферментативные свойства - высевают по 2 пробирки со средами Гисса с сахарозой, лактозой, рамнозой и глицерином, к которым добавляют индикатор Андреде, на 3 чашки Петри с агаром Хоттингера рН 7,3±0,1 и на 3 чашки Петри с агаром Хоттингера рН 7,1±0,1. Засеянные пробирки, чашки с агаром рН 7,1±0,1 помещают на (48±2) ч при температуре (27±1)°С, остальные объекты на тот же срок при температуре (37±1)°С. В том случае, если морфология колоний типична для чумного микроба (культура без диссоциации), вакцинный штамм стойко удерживает свой биохимический тип и в посевах отсутствует посторонняя микрофлора, исходную культуру I генерации пересевают в бактериологические матрацы с бульоном Хоттингера рН 7,1±0,1 (культура II генерации). Посевы инкубируют (48±2) ч при (27±1)°С. Полученную культуру II генерации засевают в бутыли с бульоном Хоттингера рН 7,1±0,1 (культура III генерации), которые подключают к установке для аэрации. Выращивание проводят (24±1) ч при температуре бульона (27±1)°С и непрерывной аэрации в объеме от 1-1,5 л воздуха на 1 л бульона. По окончании выращивания из бутылей отбирают посевной материал, в котором определяют концентрацию микробных клеток визуальным методом с помощью ОСО мутности бактериальных взвесей 42-28-85-соответствующего года выпуска (10 ME). Она должна быть не менее 2 млрд. м.к./мл. Рассчитывают количество материала, необходимого для засева, таким образом, чтобы на 1 мл засеваемой питательной среды приходилось 20 млн. м.к. Засевают в 5 флаконов объемом по 150 мл, помещают в термостат. Выращивают в течение (48±2) ч при (27±1)°С. Учет результатов проводят через (48±2) ч. После чего производят забор выращенной культуры из каждого флакона стерильной бактериологической пипеткой для определения концентрации м.к. визуальным методом с помощью ОСО мутности бактериальных взвесей 42-28-85-соответствующего года выпуска (5 или 10 ME) в каждом из 5 флаконов.

Определение процента живых микробных клеток

Из нативной взвеси делают последовательные десятикратные разведения от 10^-1 до 10^-8, используя для каждого разведения отдельную пипетку вместимостью 1 мл. Из пробирок с разведениями 10^-7 и 10^-8 высевают пипеткой по 0,1 мл взвеси на 2 чашки Петри с питательной средой для контроля жизнеспособности. Через 48-72 ч инкубации при температуре (27±1)°С подсчитывают количество колоний для каждого образца. За количество живых микробных клеток (БК), содержащихся в 1 мл взвеси одного образца, принимают среднее значение количества живых микробных клеток, полученное из двух разведений. Для этого количество выросших колоний умножают на степень разведения взвеси, из которого производили высев и увеличивают в 10 раз.

Методика подсчета процента живых микробных клеток

Количество живых микробных клеток в процентах (% живых м.к.) вычисляют для каждого образца отдельно по формуле:

где:

БК - количество живых м.к. в 1 мл;

ОК - общая концентрация.

За процент жизнеспособных клеток во взвеси принимают среднее арифметическое значение из пяти флаконов. При этом оценивается характер роста культуры на жидкой среде. Бульон должен оставаться прозрачным, при этом наблюдается агглютинативный рост с образованием рыхлого осадка на дне.

Пример 1. Вакцинный штамм чумного микроба Yersinia pestis EV выращивали на питательной среде жидкой, содержащей панкреатический гидролизат казеина - 79,0 мл; пептон сухой ферментативный - 20,0 г; натрий хлористый - 3,0 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 3,0 г; аммоний молибденовокислый 4-х водный - 0,4 г; дистиллированная вода - до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов наблюдается аглютинативный рост в виде незначительного количества взвешенных в прозрачном бульоне хлопьев с рыхлым осадком на дне пробирки, в 1,0 мл взвеси получают 800 млн. м.к., процент живых м.к. через (48±1) ч соответственно 23,1%. Тогда как на контрольной среде - бульоне Хоттингера, сбор биомассы вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV составил в 1,0 мл взвеси 700 млн. м.к., процент живых микробных клеток через (48±1) ч составил 19,5%.

Пример 2. Вакцинный штамм чумного микроба Yersinia pestis EV выращивали на питательной среде жидкой, содержащей панкреатический гидролизат казеина - 89,0 мл; пептон сухой ферментативный - 20,0 г; натрий хлористый - 5,0 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 4,0 г; аммоний молибденовокислый 4-х водный - 0,5 г; дистиллированная вода - до 1 л. При таком соотношении ингредиентов наблюдался агглютинативный рост в виде большого количества взвешенных в прозрачном бульоне хлопьев с рыхлым осадком на дне пробирки, в 1,0 мл взвеси получают 1 млрд. 300 млн. м.к., процент живых м.к. через (48±1) ч соответственно 33,7%. Тогда как на контрольной среде - бульоне Хоттингера, сбор биомассы вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV составил в 1,0 мл взвеси 700 млн. м.к., процент живых микробных клеток через (48±1) ч составил 19,5%.

Пример 3. Вакцинный штамм чумного микроба Yersinia pestis EV выращивали на питательной среде жидкой, содержащей панкреатический гидролизат казеина - 99,0 мл; пептон сухой ферментативный - 20,0 г; натрий хлористый - 6,0 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 5,0 г; аммоний молибденовокислый 4-х водный - 0,6 г; дистиллированная вода - до 1 л. При таком соотношении ингредиентов наблюдался агглютинативный рост в виде малого количества взвешенных в прозрачном бульоне хлопьев с рыхлым осадком на дне пробирки, в 1,0 мл взвеси получают 900 млн. м.к., процент живых м. к. через (48±1) ч соответственно 20,4%. Тогда как на контрольной среде - бульоне Хоттингера, сбор биомассы вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV составил в 1,0 мл взвеси 700. млн м.к., процент живых микробных клеток через (48±1) ч составил 19,5%.

Таким образом, заявленная питательная среда жидкая для культивирования и сбора биомассы вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV (пример 2), обеспечивает высокий эффект сбора биомассы с 1,0 мл взвеси - 1 млрд. 300 млн. м.к., содержащей высокий процент живых микробных клеток - 33,7%.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду жидкую для выращивания и сбора биомассы вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV, содержащую следующие ингредиенты: панкреатический гидролизат казеина 89,0 мл, пептон сухой ферментативный 20,0 г, натрий хлористый 5,0 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 4,0 г, аммоний молибденовокислый 4-водный 0,5 г, дистиллированная вода до 1 л. Изобретение позволяет обеспечить достаточный сбор биомассы с высоким процентом живых микробных клеток через 48 ч. 3 пр.

Питательная среда жидкая для выращивания и сбора биомассы вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV, содержащая следующие ингредиенты:

Панкреатический гидролизат казеина 89,0 мл Пептон сухой ферментативный 20,0 г Натрий хлористый 5,0 г Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 4,0 г Аммоний молибденовокислый 4-х водный 0,5 г Дистиллированная вода до 1 л