ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МЕНИНГОКОККОВ (МЕНИНГОАГАР) Российский патент 1998 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано в диагностике менингококковой инфекции.

Ведущими зарубежными фирмами выпускаются сухие питательные среды для культивирования и выделения N.meningitidis на основе сердечно-мозгового экстракта, ферментативных гидролизатов казеина, сои, мяса с добавлением нативной сыворотки крови, лошадиной или кроличьей [1 - 3]. Из отечественных препаратов известны: питательная среда ТЦГА, диагностическая сухая [4], которая состоит из следующих компонентов, г/л: пептон 10,0; тиамин-бромид 0,005; цистин 0,012; глутаминовая кислота 1,3; натрий хлористый 6,0; калий хлористый 0,09; магний сернокислый 0,6; аммоний хлористый 1,25; трис-буфер 1,9; глюкоза 5,0; агар 8,84; вода дистиллированная до 1 л.

Однако из-за низких диагностических качеств данная среда, снята с производства.

Известна сухая среда на основе гидролизата казеина и экстракта кормовых дрожжей - казеиново-дрожжевой агар (КДА) [5].

Недостатком этой среды является необходимость добавления нормальной лошадиной сыворотки.

В практике здравоохранения для диагностики менингококковой инфекции в основном используется 20%-ный сывороточный агар на основе гидролизата мяса по Хоттингеру [6].

Отсутствие необходимого количества отечественных стандартных питательных сред для диагностики менингита вызывает определенные трудности в работе бактериологов.

Задачей изобретения является создание сухой стандартной питательной среды, обеспечивающий стабильность результатов по ростовым свойствам и по высеваемости возбудителя менингита из клинического материала.

Поставленная задача решается сбалансированностью компонентного состава среды, содержащей питательную белковую основу, автолизат пекарных дрожжей, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов (ферментализат черного альбумина), натрий хлористый, глюкозу и агар при следующем соотношении компонентов, г/л;
Панкреатический гидролизат казеина - 10,0 ± 1,0
Автолизат пекарных дрожжей - 1,0 ± 0,1
Ферментативный гидролизат черного амбулина - 2,0 ± 0,2
Глюкоза - 5,0 ± 0,5
Натрий хлористый - 5,0 ± 0,5
Агар микробиологический - 10,0 ± 2,0
pH - 7,4 ± 0,2
Количественное соотношение компонентов питательной среды и ее pH обеспечивают повышенный уровень интенсивности роста менингококка. Кроме этого среда не требует внесения сыворотки.

Питательную среду готовят следующим образом: навески ингредиентов суспендируют в колбе с дистиллированной водой, корректируют pH, затем нагревают до полного расплавления агара и стерилизуют при 121^oC в течение 15 мин. Стерильную среду разливают в чашки Петри, пробирки.

Для биологического контроля разработанной питательной среды использовали культуру Neisseria meningitidis музейных штаммов, а также материал от больных менингитом. Все посевы инкубировали при температуре 37±1^oC в атмосфере 5 - 7% CO₂ и повышенной влажности в течение 24 ч. Полученные результаты представлены в таблице.

Пример 1. Проверка ростовых свойств предлагаемой среды производилась посевом тест-штаммов возбудителя менингита на среду следующего состава, г/л;
Панкреатический гидролизат казеина - 9,0
Автолизат пекарных дрожжей - 0,9
Ферментативный гидролизат черного альбумина - 1,8
Глюкоза - 4,5
Натрий хлористый - 4,5
Агар микробиологический - 8,0
Вода дистиллированная - до 1 л.

pH - 7,4 ± 0,2
Учет результатов производили через 24 ч инкубирования при 37 ± 1^oC в атмосфере CO₂.

Пример 2. Проверка ростовых свойств предлагаемой среды проводилась на среде с оптимальным компонентным составом, г/л%
Панкреатический гидролизат казеина - 10,0
Автолизат пекарных дрожжей - 1,0
Ферментативный гидролизат черного амбулина - 2,0
Глюкоза - 5,0
Натрий хлористый - 5,0
Агар микробиологический - 10,0
Вода дистиллированная - до 1 л.

pH - 7,4 ± 0,2
Учет результатов через 24 ч культивирования.

Пример 3. Проверка ростовых свойств предлагаемой среды проводилась на среде следующего компонентного состава, г/л%
Панкреатический гидролизат казеина - 11,0
Автолизат пекарных дрожжей - 1,1
Ферментативный гидролизат черного амбулина - 2,2
Глюкоза - 5,5
Натрий хлористый - 5,5
Агар микробиологический - 12,0
Вода дистиллированная - до 1 л.

pH - 7,4 ± 0-2
Учет результатов проводился через 24 ч инкубирования посевов.

В качестве среды сравнения использовали сывороточный агар на основе перевара Хоттингера с 20%-ной нормальной лошадиной сыворотки.

Для биологического контроля предлагаемой среды использовали тест-штаммы N. meningitidis серогрупп А-13077; А-16; В-13090; В-0657; C-13202; C-23252, полученные из ГИСК им. Тарасевича.

Морфология колоний типичная для менингококков. В косопроходящем свете свечение колоний оранжевое, что подтверждает наличие полноценной капсулы у микроба. Реакция агглютинации на стекле у культур с предлагаемой среды специфична. Картина ферментации углеводов культурами с предлагаемой среды типична для менингококков, наблюдается утилизация глюкозы, мальтозы и отсутствует утилизация сахарозы и лактозы.

Таким образом культуры, выращенные на предлагаемой среде, обладают типичными для менингококков культурально-морфологическими и биохимическими свойствами.

В процессе изучения предлагаемой среды было проведено бактериологическое обследование лиц с подозрением на заболевание менингококковой инфекцией. На чашку с предлагаемой средой сравнения высевали спинномозговую жидкость и кровь от лиц с подозрением на заболевание. За время испытания было выделено 6 культур менингококков как на среде сравнения так и на предлагаемой среде.

Учитывая полученные данные при проверке предлагаемой среды, а именно высокую чувствительность, хорошее качество выросших культур, а также простоту приготовления среды, предлагаемая среда может быть рекомендована для культивирования менингококков в лабораторных условиях, а также для выделения возбудителя от больных менингококковой инфекцией.

Источники информации.

1. The Oxoid Manual of Culture Media, ingredients and other laboratory services. (Oxoid limited 1979).

2. Difco Manual of dehydrated culture Media and Reagents for Microbiological and clinical laboratory Procedures.

3. The manual of microbiological culture media. (Gidro BRL 1988).

4. ТУ 42, 14 152-79 Тиамин-цистин-глутаминовый агар сухой (ТЦГА) Костюкова Н.Н., Гаджиева А.Г. и др.

5. Сухой казеиново-дрожжевой агар для выделения и идентификации менингококка. Лабораторное дело, 1980, N 9, 551-553.

6. Методические указания по микробиологической диагностике менингококковой инфекции и бактериальных менингитов. Приложение N 3 к приказу Минздрава СССР от 1 декабря 1988 г., N 858.

Использование; биотехнология, медицинская микробиология, диагностика менингококковой инфекции. Питательная среда для выделения и культивирования менингококков. Сущность изобретения: питательная среда в качестве белковой основы содержит панкреатический гидролизат казеина, автолизат дрожжей, ферментативный гидролизат черного амбулина (стимулятор роста гемофильных микроорганизмов), а также глюкозу, хлористый натрий и агар. Среда обеспечивает рост менингококков музейных штаммов и из материала от больных менингококковой инфекцией (гнойным менингитом), сохраняя типичную морфологию микроорганизма, что позволяет использовать ее в бактериологических исследованиях при диагностике гнойных менингитов, а также в лабораторных исследованиях. 1 табл.

Питательная среда для культивирования и выделения менингококков, содержащая питательную белковую основу, автолизат пекарных дрожжей, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, натрий хлористый, глюкозу, агар микробиологический, отличающаяся тем, что в качестве белковой основы она содержит панкреатический гидролизат казеина, а в качестве стимулятора роста - ферментативный гидролизат черного альбумина и автолизат пекарных дрожжей при следующем соотношении компонентов, г/л:
Панкреатический гидролизат казеина 10,0 ± 1,0
Автолизат пекарных дрожжей 1,0 ± 0,1
Ферментативный гидролизат черного альбумина 2,0 ± 0,2
Глюкоза 5,0 ± 0,5
Натрий хлористый 5,0 ± 0,5
Агар микробиологический 10,0 ± 2,0
Вода дистиллированная До 1 л
рН 7,4 ± 0,27