Способ получения питательной среды жидкой для культивирования и накопления микробных клеток возбудителя лептоспироза Российский патент 2025 года по МПК C12N1/38 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, а именно, к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для культивирования возбудителя лептоспироза.

Для накопления бактериальной массы лептоспир используется среда ВГНКИ, которая готовится следующим образом: необходимое количество буферной смеси Зеренсена (рН 7,2) вносят в бутыль с сифоном и стерилизуют в автоклаве при 0,8 атм в течение 30 мин, к охлажденной смеси добавляют 5-8% инактивированной сыворотки кролика или барана до концентрации белка в среде 0,22-0,25% и витамины: В₁₂ - до концентрации 1 мг/мл и B₁ - до концентрации 0,25 мл/л 6% раствора.

Смесь Зеренсена: раствор А: 11,867 г двузамещенного фосфорнокислого натрия растворяют в 1 л воды дистиллированной; раствор Б: 9,067 г однозамещенного фосфорнокислого калия растворяют в 1 л воды дистиллированной. К 72 мл раствора А добавляют 28 мл раствора Б и доводят объем водой дистиллированной до 1000 мл.

Среду фильтруют через стерилизующие пластины фильтра Зейтца и разливают в стерильные пробирки по 5-10 мл или флаконы. Для проверки на стерильность среду выдерживают при температуре 37°С в течение 3 дней и при комнатной температуре - до 10 дней [1].

Недостатками данной среды являются сложность и длительность изготовления.

Наиболее близкой к предполагаемому изобретению является среда Терских, состоящая из фосфатной смеси Зеренсена и кроличьей сыворотки.

Смесь Зеренсена дважды фильтруют через двухслойный бумажный фильтр, разливают в пробирки по 5 мл, стерилизуют в автоклаве при температуре 120°С в течение 20 мин, и стерильно добавляют в каждую пробирку инактивированную сыворотку кролика из расчета 1-2 капли на 1 мл среды. Пробирки со средой двукратно прогревают в водяной бане при температуре 56°С в течение 1 ч [1].

Недостатками данной среды являются сложность изготовления и снижение ростовых свойств при длительных пассажах культур.

Целью изобретения является разработка простой в изготовлении питательной среды жидкой для культивирования и накопления микробных клеток возбудителя лептоспироза с улучшенными ростовыми свойствами.

Сущность предполагаемого изобретения заключается в том, что в качестве основного источника азотного питания при изготовлении питательной среды жидкой для культивирования и накопления микробных клеток возбудителя лептоспироза совместно со свежевзятой сывороткой кролика, инактивированной прогреванием на водяной бане в течение 30 мин при температуре 56°С, используется коммерческий препарат -сыворотка крови лошади нормальная для культивирования микоплазм на питательных средах жидкая стерильная.

Технический результат достигается тем, что питательная среда жидкая для культивирования и накопления микробных клеток возбудителя лептоспироза, кроме основного источника питания - сывороток, содержит аммоний хлористый и тиамин, повышающие накопительные свойства среды как дополнительные факторы роста; фосфаты, обладающие буферным действием, - 12-водный двузамещенный фосфорнокислый натрий и однозамещенный фосфорнокислый калий, а также натрия хлорид и дистиллированную воду, при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

12-водный двузамещенный фосфорнокислый натрий 1,00 Однозамещенный фосфорнокислый калий 0,30 Натрия хлорид 1,00 Аммоний хлористый 0,25 Тиамин 0,005 Кроличья сыворотка нормальная инактивированная 40,0 мл Сыворотка крови лошади нормальная для культивирования микоплазм на питательных средах жидкая стерильная 20,0 мл Дистиллированная вода до 1 л

Фосфаты, 12-водный двузамещенный фосфорнокислый натрий и однозамещенный фосфорнокислый калий широко применяются при приготовлении питательных сред, что обосновано их буферным действием в физиологически важном диапазоне рН и низкой токсичностью [2].

Натрия хлорид необходим для поддержания изотоничности среды. Растворенные в питательной среде и находящиеся в состоянии электролитического распада, ионизируемые минеральные соединения являются одновременно катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке. Ионы натрия (Na⁺) участвуют в транспорте веществ через клеточные мембраны и в регуляции синтеза белка [3].

Свежевзятая кроличья сыворотка нормальная инактивированная является источником азота, альбуминов и глобулинов [4] в питательной среде жидкой для культивирования и накопления микробных клеток возбудителя лептоспироза.

Кровь для получения сыворотки брали от кроликов массой 1,5-3 кг. Животных фиксировали на спине, в месте прощупывания сердечного толчка выстригали шерсть, обрабатывали поверхность спиртом и йодом. Кровь брали, вводя иглу шприца в сердце, в количестве 30-40 мл и переливали в стерильные пробирки или флаконы. Емкость с кровью ставили в термостат при 37°С на 30-40 мин. Образовавшийся сгусток обводили металлической стерильной спицей и помещали в холодильник на 1 -2 сут.

Отстоявшуюся сыворотку сливали в стерильные флаконы емкостью 100-200 мл и инактивировали при температуре 56-58°С в течение 30 мин. Строго следили за температурой, так как перегретая сыворотка непригодна для приготовления питательных сред. Инактивированную сыворотку хранили при температуре 2-4°С [1].

Сыворотка крови лошади нормальная для культивирования микоплазм на питательных средах жидкая стерильная - коммерческий препарат, используется для интенсификации роста и ускорения процесса накопления лептоспир, при сохранении их активной подвижности.

Аммоний хлористый повышает накопительные свойства питательных сред, являясь дополнительным фактором роста; участвует в регуляции осмотического давления внутри клеток и направления биохимических реакций; благоприятно влияет на коллоидные свойства живой протоплазмы. Из литературных источников известно, что лептоспиры могут утилизировать неорганические соли аммония как главный источник азота [1].

Тиамин (витамин B₁) является фактором роста, в котором возбудители лептоспироза испытывают потребность [1]. Многие бактерии лишены способности синтезировать все необходимые для роста органические соединения, и зависят от наличия в среде определенных факторов роста. Потребность в витаминах является общим свойством всех микроорганизмов.

Дистиллированная вода, в соответствии с санитарно-гигиеническими требованиями, - прозрачная, бесцветная жидкость без запаха, содержащая: ионов аммония, нитрат-ионов, цинка - не более 0,2 мг/дм³; сульфат-ионов и хлорид-ионов - не более 0,5 мг/дм³; алюминия, железа, свинца - не более 0,05 мг/дм³; кальция - не более 0,8 мг/дм³; меди - не более 0,02 мг/дм³; имеющая удельную электропроводность при температуре 20°С не более 4,3⋅10^-4 См/м и рН - от 5,0 до 7,0 [5].

Вода составляет 80-90% от клеточной массы микроорганизмов и играет важнейшую роль в их физиологических функциях, входит в состав структурных элементов клетки, служит средой для биохимических реакций, источником кислорода в процессах метаболизма, непосредственно участвует в метаболических реакциях и реакциях гидролиза.

Подготовка посуды

Предназначенную для культивирования лептоспир посуду дезинфицировали и мыли отдельно от другой. Пользовались пробирками, обработанными по специальной методике, включающей следующие этапы:

- погружение на 24 ч в 1-2% раствор соляной кислоты в стеклянной или в эмалированной посуде;

- промывание проточной водопроводной водой (12 - 15 раз);

- обработку ершами в горячем мыльном растворе (1 кусок хозяйственного мыла на 10 л воды);

- тщательное промывание проточной водопроводной водой (12-15 раз);

- погружение в дистиллированную воду на 24 ч;

- сушку и стерилизацию вместе с ватными пробками.

Новые резиновые шланги и пробки промывали проточной водопроводной водой, кипятили в течение 30-40 мин в 2% растворе пищевой соды, промывали водопроводной водой и снова кипятили в дистиллированной воде 30-45 мин, после чего просушивали [1].

Изготовление питательной среды

Для изготовления питательной среды жидкой на весах взвешивали сухие навески: 12-водного двузамещенного фосфорнокислого натрия -1,00 г; однозамещенного фосфорнокислого калия - 0,30 г; натрия хлорида - 1,00 г; аммония хлористого - 0,25 г, тиамина - 0,005 г. Навески ссыпали в эмалированную емкость и добавляли до 1 л дистиллированную воду. На газовой плите смесь доводили до кипения, кипятили до растворения всех ингредиентов, давали остыть, корректировали рН до 7,4 и разливали по 333 мл в градуированные флаконы объемом 450 мл, завальцовывали и стерилизовали при температуре 115°С в течение 15 мин.

Охлажденную до температуры 56°С среду разливали стерильными бактериологическими пипетками вместимостью 5 мл в бактериологические пробирки высокой степени чистоты, предварительно добавив стерильно над факелом кроличью сыворотку нормальную инактивированную - по 13,3 мл на флакон (из расчета 40 мл/л) и сыворотку крови лошади нормальную для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую стерильную - по 6,7 мл на флакон (из расчета 20 мл/л). В приведенных примерах добавляемое количество сывороток варьировали с шагом 10 мл/л.

Контролировали стерильность среды выдерживанием при температуре 37°С в течение 2 сут и до 7 сут - при комнатной температуре (20-25°С), среда должна оставаться прозрачной.

Методика прямой микроскопии

Лептоспиры плохо воспринимают окраску, поэтому все наблюдения проводили с живыми возбудителями в темном поле зрения микроскопа. С этой целью использовали микроскоп с конденсором темного поля. Для выявления лептоспир методом микроскопии готовили препараты «раздавленной капли»: из пробирок с исследуемыми средами после термостатирования по 5 мкл наносили петлей на предметное стекло толщиной не более 1,0-1,1 мм и накрывали покровным стеклом толщиной 0,2 мм. Ввиду значительной величины микроба для исследования использовали сухие системы: объектив ×40 и окуляр ×10.

Ростовые свойства предлагаемой питательной среды жидкой для культивирования и накопления микробных клеток возбудителя лептоспироза оценивали в соответствии с методическими указаниями МУ 3.1.1128-02 Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний людей лептоспирозами [6] и с учетом требований СанПиН 3.3686-21 Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней [7], используя диагностические вирулентные штаммы Leptospira interrogans П.O.5621 (серогруппа Pomona); штамм М20 (серогруппа Icterohaemorrhagiae); штамм Перепелицин (серогруппа Tarassovi); штамм Ballico (серогруппа Australis); штамм Akiyami А (серогруппа Autumnalis).

Средой сравнения служила питательная среда Терских. По 0,5 мл взвесей из исходных пробирок с хранящимися культурами засевали на каждую пробирку с заявляемой и контрольной средами и культивировали при температуре 29±1°С. Рост возбудителей лептоспироза в предлагаемой и взятой для сравнения питательных средах наблюдался в виде едва заметного помутнения. Для обнаружения роста возбудителей лептоспироза с 5 по 14 сут культивирования из пробирок готовили препараты «раздавленной капли» и исследовали их в темном поле микроскопа путем просмотра 10 полей зрения при увеличении ×400. Учитывали подвижность, количество клеток в поле зрения, а также характерный морфологический признак лептоспир - крючкообразный конец микробного тела.

При обнаружении в пробирках после термостатирования лептоспир их содержимое пересевали по 0,5 мл в пробирки с 5 мл свежей питательной среды жидкой для культивирования и накопления микробных клеток возбудителя лептоспироза в каждой для дальнейшего сохранения культур.

Представлена таблица с данными о количестве клеток лептоспир, наблюдаемых в препаратах «раздавленной капли» со среды сравнения и предлагаемой питательной среды.

В препаратах «раздавленной капли» из посевов со среды сравнения через 5 сут культивирования диагностических штаммов L. interrogans наблюдали, в среднем, 63±11,8 клеток лептоспир типичной морфологии: от 48±2,6 м.к. (у штамма Ballico, серогруппа Australis) до 79±4,0 м.к. (у штамма Akiyami А серогруппа Autumnalis).

При повторном просмотре через 14 сут после посева для всех пяти штаммов наблюдалось незначительное снижение числа микробных клеток в поле зрения.

Пример 1. Испытуемые штаммы выращивали на питательной среде жидкой для культивирования и накопления микробных клеток возбудителя лептоспироза при оптимальном рН 7,4±0,2, содержащей, г/л: 12-водный двузамещенный фосфорнокислый натрий - 1,00; однозамещенный фосфорнокислый калий - 0,30; натрия хлорид - 1,00; аммоний хлористый -0,25, тиамин - 0,005. В эмалированной емкости, добавив дистиллированной воды до 1 л, кипятили 1-2 мин до полного растворения ингредиентов, давали остыть и корректировали рН до 7,4. Разливали по 333 мл в градуированные флаконы объемом 450 мл, завальцовывали и стерилизовали при температуре 115°С в течение 15 мин. Охлажденную до 56°С среду разливали стерильными бактериологическими пипетками вместимостью 5 мл в бактериологические пробирки высокой степени чистоты, предварительно добавив стерильно над факелом кроличью сыворотку нормальную инактивированную - по 10,0 мл на флакон (из расчета 30 мл/л) и сыворотку крови лошади нормальную для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую стерильную -по 3,3 мл на флакон (из расчета 10 мл/л).

При таком соотношении ингредиентов в питательной среде жидкой для культивирования и накопления микробных клеток возбудителя лептоспироза в препаратах «раздавленной капли» из посевов, выдержанных в термостате в течение 5 сут при температуре 29±1°С, в темном поле зрения при увеличении ×400 наблюдалось, в среднем, 76±5,2 типичных, активно подвижных клеток лептоспир: от 68±3,4 м.к. штамма П.O.5621 (серогруппа Pomona) до 93±3,6 м.к. штамма Akiyami А (серогруппа Autumnalis). При повторном просмотре через 14 сут после посева картина существенно не менялась.

Пример 2. Испытуемые штаммы выращивали на питательной среде жидкой для культивирования и накопления микробных клеток возбудителя лептоспироза при оптимальном рН 7,4±0,2, содержащей, г/л: 12-водный двузамещенный фосфорнокислый натрий - 1,00; однозамещенный фосфорнокислый калий - 0,30; натрия хлорид - 1,00; аммоний хлористый -0,25, тиамин - 0,005. В эмалированной емкости, добавив дистиллированной воды до 1 л, кипятили 1-2 мин до полного растворения ингредиентов, давали остыть и корректировали рН до 7,4. Разливали по 333 мл в градуированные флаконы объемом 450 мл, завальцовывали и стерилизовали при температуре 115°С в течение 15 мин. Охлажденную до 56°С среду разливали стерильными бактериологическими пипетками вместимостью 5 мл в бактериологические пробирки высокой степени чистоты, предварительно добавив стерильно над факелом кроличью сыворотку нормальную инактивированную - по 13,3 мл на флакон (из расчета 40 мл/л) и сыворотку крови лошади нормальную для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую стерильную -по 6,7 мл на флакон (из расчета 20 мл/л).

При таком соотношении ингредиентов в питательной среде жидкой для культивирования и накопления микробных клеток возбудителя лептоспироза в препаратах «раздавленной капли» из посевов, выдержанных в термостате в течение 5 сут при температуре 29±1°С, в темном поле зрения при увеличении ×400 наблюдалось, в среднем, 119±3,8 типичных, активно подвижных клеток лептоспир: от 107±2,5 м.к. штамма М20 (серогруппа Icterohaemorrhagiae) до 126±3,6 м.к. штамма Akiyami А (серогруппа Autumnalis). При просмотре через 14 сут количество типичных и подвижных клеток сохранялось.

Пример 3. Испытуемые штаммы выращивали на питательной среде жидкой для культивирования и накопления микробных клеток возбудителя лептоспироза при оптимальном рН 7,4±0,2, содержащей, г/л: 12-водный двузамещенный фосфорнокислый натрий - 1,00; однозамещенный фосфорнокислый калий - 0,30; натрия хлорид - 1,00; аммоний хлористый -0,25, тиамин - 0,005. В эмалированной емкости, добавив дистиллированной воды до 1 л, кипятили 1-2 мин до полного растворения ингредиентов, давали остыть и корректировали рН до 7,4. Разливали по 333 мл в градуированные флаконы объемом 450 мл, завальцовывали и стерилизовали при температуре 115°С в течение 15 мин. Охлажденную до 56°С среду разливали стерильными бактериологическими пипетками вместимостью 5 мл в бактериологические пробирки высокой степени чистоты, предварительно добавив стерильно над факелом кроличью сыворотку нормальную инактивированную - по 16,7 мл на флакон (из расчета 50 мл/л), и сыворотку крови лошади нормальную для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую стерильную -по 10,0 мл на флакон (из расчета 30 мл/л).

При таком соотношении ингредиентов в питательной среде жидкой для культивирования и накопления микробных клеток возбудителя лептоспироза в препаратах «раздавленной капли» из посевов, выдержанных в термостате в течение 5 сут при температуре 29±1°С, в темном поле зрения при увеличении ×400 наблюдалось, в среднем, 251±13,9 клеток лептоспир: от 221±3,2 м.к. штамма Ballico (серогруппа Australis до 281±3,8 м.к. штамма Akiyami А (серогруппа Autumnalis), однако из-за спонтанной агглютинации подсчет клеток всех испытуемых штаммов был затруднен. Во всех пробирках, при просмотре через 14 сут культивирования, наблюдалось снижение числа лептоспир, их количество, в среднем, составило 134±2,7 м.к.: от 130±3,0 м.к. штамма Ballico (серогруппа Australis) до 142±8,7 м.к. штамма П.O.5621 (серогруппа Pomona).

Таким образом, заявленная питательная среда жидкая для культивирования и накопления микробных клеток возбудителя лептоспироза (пример 2) является оптимальной по количеству полученных клеток лептоспир с типичной морфологией и активной подвижностью, наблюдаемых в препаратах «раздавленной капли» в темном поле зрения микроскопа при увеличении ×400.

Питательная среда качественная, простая в изготовлении, при культивировании возбудителей лептоспироза полноценные микробные клетки формируются на 5 сут, снижения роста не наблюдается до 14 сут (срок наблюдения).

Список использованной литературы

1. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство / Под редакцией академика РАМН Г.Г.

Онищенко и академика В.В. Кутырева. Изд. 2-е, переработанное и дополненное. - Москва.: ЗАО «Шико», 2013. - С. 468-498.

2. Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов. - М., 1986.

3. Меджидов М.М. Справочник по микробиологическим питательным средам. М., «Медицина», 2003. - С. 18.

4. Перетрухина А.Т., Блинова Е.И. Бактерийные и вирусные препараты: учебное пособие для студентов высших учебных заведений, обучающихся по специальности: 020209.65 - "Микробиология" и направлений подготовки 020400.62 - "Биология" (бакалавриат), профиль "Микробиология"; 020400.68 - "Биология" (магистратура), профиль "Микробиология" / А.Т. Перетрухина, Е.И. Блинова; Федер. агентство по рыболовству, ФГБОУ ВПО "Мурм. гос. техн. ун-т". - Москва: Изд. дом Акад. Естествознания, 2011. - 311 с.

5. ГОСТ Р 58144-2018. Вода дистиллированная. Технические условия.

6. МУ 3.1.1128-02 Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний людей лептоспирозами. - Минздрав России, - Москва. - 2002.

7. Санитарные правила и нормы СанПиН 3.3686-21 Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней. - Москва, МЗ РФ. - 2021.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения питательной среды жидкой для культивирования и накопления микробных клеток возбудителя лептоспироза, включающий смешивание сухих навесок: 12-водного двузамещенного фосфорнокислого натрия - 1,00 г, однозамещенного фосфорнокислого калия - 0,30 г, натрия хлорида - 1,00 г, аммония хлористого - 0,25 г, тиамина - 0,005 г в емкости и добавление до 1 л дистиллированной воды, смесь доводят до кипения, кипятят до растворения всех ингредиентов, дают остыть, корректируют рН до 7,4 и разливают в градуированные флаконы, завальцовывают и стерилизуют при температуре 115°С в течение 15 мин, охлаждают до температуры 56°С, стерильно вносят кроличью сыворотку нормальную инактивированную из расчета 40 мл/л и сыворотку крови лошади нормальную для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую стерильную из расчета 20 мл/л, и стерильно разливают из флаконов бактериологическими пипетками в бактериологические пробирки. Изобретение позволяет получить простую в изготовлении питательную среду жидкую для культивирования и накопления микробных клеток возбудителя лептоспироза, при этом повысить число формируемых микробных клеток, сохраняя их типичную морфологию и активную подвижность при пассировании штаммов до 14 сут (срок наблюдения). 1 табл., 3 пр.

Способ получения питательной среды жидкой для культивирования и накопления микробных клеток возбудителя лептоспироза, включающий смешивание сухих навесок: 12-водного двузамещенного фосфорнокислого натрия - 1,00 г, однозамещенного фосфорнокислого калия - 0,30 г, натрия хлорида - 1,00 г, аммония хлористого - 0,25 г, тиамина - 0,005 г в емкости и добавление до 1 л дистиллированной воды, смесь доводят до кипения, кипятят до растворения всех ингредиентов, дают остыть, корректируют рН до 7,4 и разливают в градуированные флаконы, завальцовывают и стерилизуют при температуре 115°С в течение 15 мин, охлаждают до температуры 56°С, стерильно вносят кроличью сыворотку нормальную инактивированную из расчета 40 мл/л и сыворотку крови лошади нормальную для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую стерильную из расчета 20 мл/л, и стерильно разливают из флаконов бактериологическими пипетками в бактериологические пробирки.