ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ПЛОТНАЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БРУЦЕЛЛ ВИДА Brucella neotomae Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии, именно к разработке питательных сред, которые создают оптимальные условия для культивирования бруцелл вида Brucella neotomae.

Известна питательная среда - для культивирования бруцелл вида Brucella neotomae, содержащая, г/л: печеночный настой, к 500 мл которого добавляют 500 мл водопроводной воды, 10 г сухого пептона, 5 г химически чистого хлористого натрия и 25 г агар-агара, промытого водопроводной водой и хорошо отжатого, рН среды устанавливают 7,8. Затем среду варят до полного расплавления агара и разливают в необходимую посуду (по 1-2 л). В дальнейшем среду автоклавируют при 115°С в течение 20 минут, отстаивают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, предварительно смоченный теплой водой, и вновь устанавливают рН 7,1-7,2. Среду разливают в необходимую посуду и стерилизуют при 115°С в течение 20 минут. (Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей. Методические указания МУ 3.1.7.1189-03. С. 53)

Недостатком данной среды является низкая питательная ценность для культивирования бруцелл вида Brucella neotomae.

Наиболее близкой к заявляемому изобретению является питательная среда для культивирования бруцелл вида Brucella neotomae, содержащая, г/л: мясопептонный агар для выращивания бруцеллезного микроба, основой которой является мясная вода - до 1000,0 мл; пептон ферментативный - 10,0 г; натрия хлорид - 5,0 г; кровь - 10,0 г; агар микробиологический - 15,0-20,0 г; рН 7,3±0,2. Среду автоклавируют 30 мин при температуре 121°С (М.С. Поляк; В.И. Сухаревич; М.Э. Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2008. - С. 64-65.; С. 269).

Недостатком данной среды является необходимость длительного выращивания, ввиду позднего роста возбудителя.

Целью изобретения является разработка рецептуры питательной среды плотной для культивирования бруцелл вида Brucella neotomae, которая обеспечивает активный рост уже через 24 ч.

Сущность предполагаемого изобретения заключается в том, что в качестве основного источника азотистого питания в предлагаемой среде используют печеночный отвар, пептон ферментативный, сыворотку крови плодов коровы жидкую, для поддержания изотоничности среды и окислительно-восстановительного потенциала - натрий хлористый, в качестве стимулирующих добавок - глюкозу, глицерин и натрия метабисульфит, а также агар микробиологический, питьевую воду, при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Печеночный отвар 300-700 мл Пептон сухой ферментативный 8,0-12,0 г Сыворотка крови плодов коровы жидкая 25,0-125,0 мл Натрий хлористый 4,0-6,0 г Глюкоза 5,0-15,0 г Глицерин 15,0-25,0 мл Натрия метабисульфит 0,1-0,5 г Агар микробиологический 13,0-17,0 г Питьевая вода до 1 л

В качестве исходного сырья используют печень крупного рогатого скота, содержащую 70-75% воды, 12-14% белка, 2-6% липидов, 2-8% углеводов, коферменты, витамины, гормоны, разнообразные низкомолекулярные органические вещества, а также катионы и анионы натрия, калия, марганца, кальция, меди, железа, цинка, магния, хлора, йода, серы в общем количестве не более 1%, ферментов - 2,5%. В печени содержится 50-100 мг/100 г свободных аминокислот (при расчете на азот). Общее содержание азота всех азотсодержащих экстрактивных веществ печени составляет примерно 250-300 мг/100 г, причем значительная часть этого азота приходится на долю полипептидов (Б.В. Петровский. Большая медицинская энциклопедия. Москва. Издательство «Советская энциклопедия». 1982 г. Том №19. С. 458-459). Поэтому печеночный отвар является хорошей питательной субстанцией при производстве питательных сред. Кроме того, печень богата макроэлементами, мг/кг: цинк - 3,0; марганец - 0,1; медь - 0,7; кобальт - 0,002; йод - 0,02; макроэлементами, в %: калия - 0,26; магния - 0,2; серы - 0,002; аминокислотами, в г/кг: аргинина - 2,5; гистидина - 3,6; треонина - 2,5; лейцина - 6,3; изолейцина - 1,5; аргинина-2,5; фенилаланина - 4,5; и витаминами, мг/кг: каротина (витамин А) - 1,6; В₁-0,1; В₂ - 0,3; В₃ (пантотеновая кислота) - следы; В₄ (холин) - 50,0; В₅ - 6,0; В₆ - 1,0. (И.В. Петрухин, 1989, С. 1-526). (М.Ф. Нестерин, И.М. Скурихин. Химический состав пищевых продуктов. Москва. «Пищевая промышленность». 1979. 247 с).

Печень говяжья - субпродукт, ГОСТ 2.114-95. Производитель: мясокомбинат, г. Светлоград Ставропольского края.

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей - ГОСТ 13805-76. Производитель ООО «НПО «Порт-Петровск».

Сыворотка крови плодов коров жидкая С 273 К 350. Срок годности до 2018 года, стерильная. Производство г. Минск.

Натрий хлористый, хч, ГОСТ 4233-77, партия 24. Бактерии нуждаются в минимальном количестве солей. Будучи растворены в питательной среде и находясь в состоянии электролитического распада, ионизируемые минеральные соединения являются одновременно катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке.

Глюкоза кристаллическая - ЧДА, партия 20140327, ООО «МСД Торговая компания». Срок годности 3 года. С внесением в питательную среду глюкозы в концентрации 1% улучшаются ее ростовые свойства.

Глицерин - ГОСТ 6259-75, партия 21/2015. Дата выпуска 04.2015. Срок годности 3 года. С внесением в питательную среду глицерина в концентрации 2% - улучшаются ее ростовые свойства.

Натрия метабисульфит - ГОСТ 11683-76, в средах переходит в гидросульфит натрия, при нагревании происходит термическое разложение с выделением двуокиси серы (SO₂), что способствует нейтрализации продуктов жизнедеятельности культивируемых микроорганизмов.

Агар микробиологический - агар бактериологический (европейский тип). Производитель: «Pronadisa», Испания. Партия LF 15130184. Срок годности до 10.2017 г. Дата изготовления: октябрь 2013 г. Порошок светло-кремового цвета сероватого оттенка, запах без постороннего, свойственный студню с массовой долей сухого агара 0,85%. Температура плавления студня с массовой долей сухого агара 0,85% не ниже 80°С, температура застудневания - 30-37°С, прочность студня не менее 350±40 г. Главная особенность агара - его желирующая способность при 90°С.

Питьевая вода - ГОСТ Р 51232-98, отвечает всем гигиеническим требованиям. Вода составляет 80-90% от клеточной массы микроорганизмов и играет важную роль в их физиологических функциях. Она входит в состав структурных элементов клетки, служит средой для биохимических реакций, источником кислорода в процессах метаболизма, непосредственно участвует в метаболических реакциях, например в реакциях гидролиза. Вода является хорошим растворителем, обеспечивая клетку питательными веществами. Вода - важнейший компонент всех питательных сред. При отсутствии воды замедляются или полностью прекращаются процессы жизнедеятельности микроорганизмов.

Приготовление печеночного отвара.

Способ приготовления питательной основы для культивирования бруцелл вида Brucella neotomae заключается в следующем: фарш из свежей говяжьей печени заливают питьевой водой (1 л на 1 кг фарша), затем настаивают 3 ч при 25-30°С или 6-10 ч при 4-10°С, затем варят около 2 ч; после варки отвар фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют при 115-120°С 20 мин. (Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Москва «Медицина» 1982. 82. с).

Приготовление питательной среды плотной

Питательную среду на основе печеночного отвара для культивирования бруцелл вида Brucella neotomae на основе печеночного отвара готовят следующим образом: соединяют, г/л: печеночный отвар – 500 мл; пептон ферментативный - 10,0 г; натрий хлористый - 5,0 г; агар микробиологический - 15,0 г; водопроводная вода - до 1 литра. Затем среду кипятят до полного растворения ингредиентов, устанавливают рН 7,2±0,1 с помощью 20% раствора натрия гидроокиси, добавляют глюкозу - 10,0; глицерин - 20,0; натрия метабисульфит - 0, 3; тщательно перемешивают, разливают по 330 мл питательной среды в градуированные флаконы объемом 450 мл, затем стерилизуют при 1 атм. в течение 20 мин. После стерилизации охлаждают до 56°С, стерильно над факелом добавляют в каждый флакон по 25,0 мл сыворотки крови плодов коровы жидкой (т.е. на 1 л среды 75 мл сыворотки), затем разливают на чашки Петри по 35-40 мл питательной среды. Подсушенные чашки помещают в термостат на 48 ч при 37°С - проверяют на стерильность.

Сочетанное применение вышеописанных ингредиентов обеспечивает существенное усиление ростовых качеств при культивировании бруцелл вида Brucella neotomae, а именно образование колоний микроорганизма в значительно ранние сроки - уже через 24±1ч на пластинках питательного агара. Готовую питательную среду плотную используют для культивирования бруцелл вида Brucella neotomae.

Качество полученной среды оценивают в соответствии с методическими указаниями (МУ 3.3.2.2124-06) «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза», Москва, 2007 г., с использованием вирулентных культур, выделенных от крыс, морских свинок, мышей: Brucella neotomae биотип 1 325; Brucella neotomae биотип 1 66/2; Brucella neotomae 5K 33; Brucella neotomae 65/196.

Испытуемые культуры выращивают в бактериологических пробирках на поверхности скошенного агара, рН 7,2±0,1, при температуре 37°С в течение 48 ч. Двухсуточные культуры тест-штаммов бруцелл смывают с поверхности скошенного агара 0,9% раствором натрия хлорида, доводят концентрацию микробной взвеси до 10 единиц по оптическому стандарту мутности ОСО 42-28-85 ФГБУ НЦЭСМП МЗ России, эквивалентную 1,7×10⁹ бруцелл в 1 мл. Полученную микробную взвесь культуры разводят сначала до концентрации 1×10⁹ м.к./мл, затем серийными десятикратными разведениями до 1×10^-6 и 1×10^-7 м.к./мл. В процессе разведения перенос взвеси в следующую пробирку производят стерильной пипеткой объемом 1 мл, меняя пипетку для каждого разведения. По 0,1 мл каждой культуры бруцелл вида Brucella neotomae из разведений 10^-6 (100 м.к.) и 10^-7 (10 м.к.) высевают на 3 чашки Петри с испытуемыми средами и равномерно распределяют покачиванием по всей поверхности. Посевы инкубируют при температуре 37±1°С.

Оценку ростовых свойств питательной среды плотной для культивирования бруцелл вида Brucella neotomae проводят путем подсчета количества выросших колоний бруцелл посуточно на пластинках агара с плотной питательной средой через каждые 24-48-72-120 ч. В качестве контроля используют агар Альбими.

Пример 1. Культуры выращивали на питательной среде плотной для культивирования бруцелл вида Brucella neotomae, содержащей, г/л: печеночный отвар - 300 мл; пептон сухой ферментативный - 8,0 г; сыворотку крови плодов коровы жидкую - 25,0 мл; натрий хлористый - 4,0 г; глюкозу - 5,0 г; глицерин - 15,0 мл; натрия метабисульфит - 0, 1 г; агар микробиологический - 13,0 г; питьевая вода - остальное. При таком соотношении ингредиентов на испытуемой среде при культивировании бруцелл вида Brucella neotomae через 40 часов обнаруживался видимый рост колоний, через 48 ч отмечался интенсивный рост в виде газона при посеве 0,1 мл из разведения 10^-1, при посеве из разведения 10^-6 вырастало 77 колоний, из разведения 10^-7 вырастало 11 типичных по морфологии колоний, а на агаре Альбими рост отсутствовал и на 5 сутки при посеве 10 м.к. и 100 м.к., на 6 сутки вырастало 10 колоний из разведения 10^-6.

Пример 2. Культуры выращивали на питательной среде плотной для культивирования бруцелл вида Brucella neotomae, содержащей, г/л: печеночный отвар - 500,0 мл; пептон сухой ферментативный - 10,0 г; сыворотку крови плодов коровы жидкую - 75,0 мл; натрий хлористый - 5,0 г; глюкозу - 10,0 г; глицерин - 20,0 мл; натрия метабисульфит - 0,3 г; агар микробиологический - 15,0 г; питьевая вода - остальное.

При таком соотношении ингредиентов на испытуемой среде при культивировании бруцелл вида Brucella neotomae колонии начинали формироваться уже через 24 часа, а через 48 ч отмечался интенсивный сплошной рост в виде газона при посеве 0,1 мл из разведения 10^-1, при посеве из разведения 10^-6 вырастало 112 колоний, из разведения 10^-7 вырастало 37 типичных по морфологии колоний, на агаре Альбими начальный рост обнаруживался в конце 4 суток только при посеве из разведения 10^-6 в количестве 18 колоний.

Пример 3. Культуры выращивали на питательной среде плотной для культивирования бруцелл вида Brucella neotomae, содержащей, г/л: печеночный отвар - 700,0 мл; пептон сухой ферментативный - 12,0 г; сыворотку крови плодов коровы жидкую - 125,0 мл; натрий хлористый - 6,0 г; глюкозу - 15,0 г; глицерин - 25,0 мл; натрия метабисульфит - 0, 5 г; агар микробиологический - 17,0 г; питьевая вода - остальное.

При таком соотношении ингредиентов на испытуемой среде при культивировании бруцелл вида Brucella neotomae колонии начинали формироваться через 57 часов, через 48 ч отмечался интенсивный рост в виде газона при посеве 0,1 мл из разведения 10^-1, при посеве из 10^-6 разведения вырастало 48 колоний, из разведения 10^-7 вырастало 7 типичных по морфологии колоний, а на агаре Альбими рост отсутствовал даже на 5 сутки при посеве и 10 м.к., и 100 м.к., на 6 сутки вырастало 6 колоний из разведения 10^-6.

Таким образом, заявленная питательная среда плотная для культивирования бруцелл вида Brucella neotomae (пример №2) является оптимальной по количеству подобранных ингредиентов, что позволяет получить достаточное количество колоний в максимально ранние сроки -уже через 24±1 ч.

Изобретение относится к биотехнологии. Питательная среда плотная для культивирования бруцелл вида Brucella neotomae содержит печеночный отвар, пептон сухой ферментативный, сыворотку крови плодов коровы жидкую, натрий хлористый, глюкозу, глицерин, метабисульфит натрия, микробиологический агар и питьевую воду при заданном соотношении компонентов. Изобретение обеспечивает образование колоний бруцелл в ранние сроки (24±1 ч), что позволяет оптимизировать продолжительность процесса диагностики бруцеллеза. 3 пр.

Питательная среда плотная для культивирования бруцелл вида Brucella neotomae, при следующем соотношении ингредиентов:

печеночный отвар 300-700 мл пептон сухой ферментативный 8,0-12,0 г сыворотка крови плодов коровы жидкая 25-125 мл натрий хлористый 4,0-6,0 г глюкоза 5,0-15,0 г глицерин 15-25 мл натрия метабисульфит 0,1-0,5 г агар микробиологический 13,0-17,0 г питьевая вода до 1 л