Способ получения маннана Советский патент 1983 года по МПК C12P19/04 

а

X)

:л

Изобретение относится к микробиологической промЕошленности, а имено к синтезу биополимеров, в частности маннанов, используемых в медицинской промышленности.

Известен способ получения манна-на, заключающий в ферментации на питательной среде дрожжей рода Rhodo- torula отделением культуральной жидкости суперцентрифугированием, осаждении масс -сырца, из нативного раствора этанолом, очистки реактином Фелинга,разрушении медно-маннанового комплекса 1н НС1 и осаждении четырьмя объемами метанола Cl3«

Активность получаемого по известному способу маннана невысока, что и является недостатком данной технологии.

Наиболее близким к изобретению по 1ехнической сущности и достигаемому э фекту является спосоЬ получения маннана, согласно которому дрожжи рода Rhodotorula выращивают на питательной среде, содержащей глюкозу в качестве источника углерода, минеральные соли, витамины, отделяют затем культуральную жидкость суперцентрифугированием и полченный натнвный раствор доводят до рН 6,5w7,0, после чего упаривают в вакууме в 8-10 раз, осаждают маннан-сырец р.авным объемом этано ла при рН 4,8-5,0, осадок деонизируют катионитом и осаждают этанолом Известный способ позволяет получать большие количества маннана со стабильными параметрами, пригодного для использования в качестве биологически-активного соединения. Выход очищенного маннана составляет около 55% по отношению к маннану-сырцу { 2 .

Однако известный способ является многостадийным, требует значительного расхода химический реагентов , а применение в.процессе выделения маннана стадии вакуум-выпаривания приводит к уменьшению биологической активн-ости препарата и большим энергозатратам.

Цель изобретения - повышение выхода маннана, упрощение процесса и уменьшения расхода используемых реагентов.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения маннана, предусматривающему культивирование дрожжей рода Rhodotorula на питательной среде, содержащей глюкозу в качестве источника углерода, минеральные соли и витамины, отделение культуральной жидкости от биомассы, подщелачивание нативного раствора до рН 6,5-7,0, концентрирование с последующим выделением и очисткой целевого продукта,. предусмотрено после отделения культуральной жидкости от биомассы, нативный

раствор нагревать до 40-70 С, а коицентрирование осуществлять путем ультрафильтрации на гидратцеллюлозных мембранах, имеющих производительность по воде при давлении 0,1 МПа 25-62 , предварительно обработанных водой при С и давлении 0,1-0,.2 Мпа.

Предварительный нагрев нативного раствора до 40-70°С позволяет про0 вести его концентрирование и частичную очистку методом ультрафильтрации. Использование же ультрафильтрации при температурах меньше нецелесообразно ввиду низкой производительности процесса и потерь целевого продукта. Повышение температуры нативного раствора выше 70° С также нежелательно из-за возможного протекания деструкции полисахарида и снижения его биологической активности. Использование полимерных мембран с указанными характеристиками обусловлено следующими причинами. При значениях производительности мем5 брав выше 62 не достигается необходимая степень задерживания целевого продукта, а применение мембран с,водопроницаемостью ниже 25 л/м-ч нецелесообразно ввиду их

Q недостаточной производительности.

Ультрафильтрацию необходимо про эодить на гидратцеллюлозных мембранах ввиду того, что ультрафильтраты из других полимерных материалов не об ладают достаточной устойчивостью в

среде культуральной жидкости при повышенных температурах и не могут быть использованы для концентрирования маннан-содержащих растворов. Пример. В качестве продуцента полисахарида используют дрож-жи RhodotoCula rubra штаммВКМ .

В качестве посевной и ферментационной сред используют среду следующего состава:

5 .

/NH4/2.S04 2,5 г

1,0 г

КН-2.Р04

0,5 г MgSO. 7H.J.O 0 NaCl . 0,1 г 0,1 г

Витамины: В 0,4 мг; В 0,2 мг; 6 0,4 мг Глюкоза 50 г

на 1 л водопроводной воды с рН 5,3.5,4.

Среду разливают в колбы Эрленмейера емкостью 750 мл по 300 мл и , стерилизуют в автоклаве при 0,5 ати в течение 30 мин. Раствор витаминов, стерилизованный ультрафиолетовыми лучами, вносят непосредственно перед завесом культуры.

Для выращивания посевного материала производят засев среды двух-трехсуточной культурой дрожжей, выращенной на сусло-агаре при 25С, в виде 2 млрд, взвеси по бактериальному ртандарту по 7,5 мл в колбу. Подращивание ведут в течение 48 ч при :24-25с и перемешивании 220 об./мин. .Полученныйинокулум вносят в ферментационные колбы в количестве 10 мл ;И выращивают при тех же .температурах .и режиме перемешивания.

Полученную в результате ферментации культуральную жидкость отделяют от kлeтoк суперцентрифугированием. при 28-29 тыс.об./мин.

Полученный нативный раствор, содержащий 2,0-2,2 г/л маннана подщелачивают 0,1 и раствором МаОН до рН 6,5, нагревают до и концентрируют ультрафильтрацией на гидратцеллюлозных мембранах с производительностью по воде 25-62 л/м ч.

Ультрафильтрацию проводят на фильтре мембранном ФМ02-1000 при давлении 0,3 МПа. Перед ультрафильтрацией в ячейку заливают воду с температурой и под давлением 0,1 0 0,2 МПа проводят обработку мембран в течение 0,5-1 ч. Удьтрафильтрацию проводят до тех пор, пока объем ис.ходного раствора не уменьшится в 10-12 раз.

15

В таблице представлены данные ло концентрированию.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАННАНА путем культивирования дрожжей рода .Rhedotorula на питетбльной среде, содержащей глюкозу в качестве источника углерода, минеральные соли и , отделения культуральной жидкости от биомассы, подщелачивания нативного раствора до рН 6,5-7,0, концентрирования с посотёдующим выделением и очисткой целевого продукта, отличающийся тем что, с цельюувеличения выхода маннана, упрощения процесса и уменьшения расхода используемых реагентов, после отделения культуральной жидкости от биомассы нативный раствор нагревают до 40-70 0, а концентрирование осуществляют ультрафильтрации на гидратцеллкЛозных мембранах, имеющих производи- . тельность по воде при давлении 0,1 МПа 25-62 л/м-ч, предварительно л обработанных водой при 90-120 С и давлении 0,1-0,2 МПа.

I

25

II

44 62 44 44 44 44 44 44

III I I I I I I 11

I I

Холостой опыт Мембрана разру цилась после трех циклов

Концентрат, полученный в результате ультрафильтрации, центрифугируют при 6000-7000 об./мин. К центрифугату добавляют 12,5 мл реактива Фелинга. Выпавший осадок медноманнанозого комплекса отделяют от маточника на воронке Бюхнера, промывают 2%-ным водн1лм раствором КОН, .затем этанолом. Промытый осадок переносят в стакан, добавляют 80 мл дистиллированной воды, 6,25 г катионита КУ-2-8/Н/ и перемешивают в течение 30 мин. Деионизированный

20,9

60 60 60 40 50 70 70 60 35 25,4 29,7 4/5 18,3

36,5 e

25,6 2,46

раствор маннана отфильтровывают от катионита КУ-2-8 на воронке Бюхнера. Последний проьывают 80 1ЛП дистиллированной воды,, промывные воды присоединяют к основному раствору, производят корректировку рН, доводя его значение до

4,8-5,0 раствором NaOH, и осаждают двумя объемами этилового спирта. Осадок чистого маннана промывают этиловым спиртом и сушат в вакууме. Выход очищенного маннана составляет око-ПО 65% по отношению к маннану-сырцу. концентрирования,

51011685

Использование предлагаемого продукта. Предлагаемый способ позспосова получения маннана позволяет воляет существенно снизить расход полностью исключить из технологичес- химических реагентов, упростить кого процесса стадии вакуум-упарива- оборудование и увеличить выход очиния, корректировки рН, осаждения. щенного маннана на 10% (б5% против

спиртом и др., т.е. избежать проме- 55%)по отношению к маннану-сырцу, жуточного выделения маннана-сырца полученному по известному спосои, соответственно, потерь целевого бу ,