Способ получения липосом Советский патент 1983 года по МПК A61K9/10 A61K35/12 

Изобретение относится к медицине а именно к способу получения органо тропных липосом, которые могут быть использованы в кардиологии, онкологии и других отраслях медицины. Известен способ получения липосо с использованием ткани печени Ij . Известен также способ получения липосом, включающий смешение фоЬфолипидов живой ткани с действующими веществами 2 . Однако известные способы не обес печивают получения липосом с достаточной органотропностью, так как применяются липидные компоненты из различных неидентичных к данной ткани фосфогликолипидов, а для создания заряда на поверхности липо сом и придания peaKUHOfjHoB способности применяют не встречающиеся в плазматической мембране химические вещества, вследствие чего теряется сродство липосом с природными мембранами тканей. Целью изобретения является повышение органотропности. Поставленная цель достигается тем, что в способе получения липосом, включающем смешение фосфолипидов живой ткани с действующими веществами, предварительно смешивают фосфолипидк и холестерин, выделенны из определенного количества живой ткани, и после добавления действующих веществ в полученную смесь вводят ганглиозиды, выделенные из того же количества одноименной ткани. Способ осуществляют следующим образом. Сначала выделяют из ткани меченные фосфогликолипиды, для этого И-ацетил( 4,5,6 ,7,8,9,14-С)нейтрами новую кислоту в количестве 5 мкКи, удельной активностью 259 мКи/ммоль вводят кролику весом 3 кг внутривен но и через 1 ч забивают декапитацие извлекают мозг, сердце, печень, легкие, почки, селезенку, склетные мышцы, поджелудочную железу и экстр гируют липиды в хлороформ-метаноле (2:1) из расчета 20 мл на.1 г ткани Ганглиозидные фракции выделяют из общих липйдов, диализуют против дистиллированной воды и хранят при до использования. В другой .сери опытов вводят кролику 1-е -пальмитат в комплексе с бычьим сывороточным альбумином внутривенно, через час забивают животное дйкапитацией и извлекают все органы, экстрагируют общие липиды по Фольчу и очищают фосфолипиды тонкослойной хроматогра фией. Органную специфичность фосфогликолипидных липосом определяют по ганглиозидиому составу тканей (см. табл.}:). Как видно из получен ных данных, введенные фосфолипид -с -Ганглиозидные липосомы преимущественно связываются с теми органами, из липйдов которых были изготовлены органоспецифические везикулы. Б органах-мишенях введенные радиоактивности накапливались в количестве от трех до десяти раз большем, чем в органах не мишенях. Извлеченные таким способом липосомы являются «естественными прототипами клеток тканей. Для того, чтобы доказать, что поверхностные ганглиозиды тканей определяют процесс узнавания клеток, были введены внутривенно кроликам 1-е -пальмитат -фосфолипидные липосомы печени Оез Гс1нлиозидов и изучено их распределение по органам (см. табл. 2). ъсли сравнить результаты табл. 1 и 2, то видно, что за процессы клеточного узнавания ответственны ганглиозиды плазматических мембран тканей, фосфолипид-холестериновые фракции как в липосомах, так и в естественных мембранах играют структурную роль, т.е. способствуют поддержанию конфигурации мембран в наиболее оптимальном состоянии в условиях in vitro и целостного организма. Ка основе полученных экспериментальных закономерностей направления органоспецифических фосфолипид-ганглиозидных липосом была изучена избирательная транспортировка Н -оуабаина и 8-Н-аденозин-3,5-циклофосфата-цАМФ, инкапсулированных в липосомы Е1 мьапцу сердца. Экстрагируют общие липиды из миокарда кролика, отделяют фосфолипиды, холестерин, ганглиозиды. Смесь фосфолипидов и холестерина, соответствующая двум граммам ткани, выпаривают от хлороформа досуха, затем добавляют 300 мкС оуабатна или цАМФ и 2 мл Кребс-Рингер- фосфатного буфера, рН.- 7,4. встряхивают до образования эмульсии, озвучивают при 22 кГц на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-1 . 4 С 45 ев электрическом поле 2,5, В, диализуют в течение суток/ против дистиллированной воды. После этого к липосомам добавляют ганглиозиды сердца,- вьщеленные из двух граммов ткани, и тщательно перемешивают. Этот липосомальный препарат вводят кроликам и через 1 ч забивают животных дйкапитацией, извлекают органы, экстрагируют препараты после гомогенизации в абсолютном этаноле, центрифугируют и в супернатанте считают радиоактивность в жидкостносцинтиляционном счетчике. Полученные результаты представлены в табл. 3, 4. Как видно из полученных результатов, введение оуабаина внутрь фосфолипид-ганглиозидных липосом способствует в 10-12 раз большему накоплению препарата в мышце сердца, а в других изученных тканях существенных отличий от контроля не отмечается.

Экзогенный цДМФ не проникает через плазматические мембраны тканей, но при окружении липидной везикулой повышается сродство со структурой тканей.

Липосомы, содержащие ганглиозиды, поглощаются быстрее и в большей степени, а в мышце сердца накапливаются н-цАМФ в этих услоьиях в пять раз больше, чем без ганглиозида, что свидетельствует о повышении органотропности и специфичности к миокарду.

Распределение фосфолипид-с -ганглиозидных липосом в различных органах кролика (активность в имп/мин/г ткани) (количество опытов 4)

Предлагаемый способ по сравнений с известным споособом обеспечивает повышение органотропности лекарственных препаратов с помощью фосфолипид-ганглиозидных липосом, способствует избирательной доставке к больному месту без повреждения здоровых тканей.

При применении этого способа уменьшается доза введения различных лекарств при равноценном достижении лечебного эффекта. Благодаря введению лекарств в липосомах уменьшается токсичность и появляется возможность для введения непроникающих препаратов внутрь клетки органа-мишени. Способ найдет применение при лечении болезней сердца, опухолей, наследственных нарушений.

Таблица 1

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМ, включагаций смешение фосфолипидов живой ткани с действующими веществами, отличающийся тем, что,.с целью повышения органотропности, предварительно смешивают .фосфолипиды и холестерин, вьщеленные из определенного количества живой ткани, и после добавления действукицих веществ в полученную смесь вводят ганглиозиды, вьщеленные из того же количества одноименной ткани.

383.066 243084 213356 206902 240968 225460

216816

ная 215989

22701156826±87 290121

2701184260+421 165+12 ,2

204113606±59 32401216 305±26

224116660±71 215+16 2206+159

200+18620183 294±23 300126

238119606±59 132 + 9,6- 154+13

841+63156118 186+.16 320 + 21

268121408±31 211116 Органоспецифические липосош ткани легкие

157il2 236119 319t26 35161293 3315±283 229116

ка

ые

507141 22bil3

доч н ая

121-5.7,2 492.146

Примечание. Количество фосфолипидов, ганглиозидов, холестерина на липосоме соответствует 2 г ткани. Липосомы вводят в ушную вену кроликов, забивают декапитацией через 1 ч. Радиоактивность определяют в общей липидной фракции исследованных органов на жидкостно-сцинтиляционнбм ,счетчике Марк Ш.

Распределение l-C -пальмитат-фосфолипидных липосом мозга в различных органах кролика (активность в имп/мин/г ткани). ,(Количество опытов 4)

Скелетные Почки Мозг Печень Сердце | Селезенка ПоджелудочмышцыI железа

- - -- -11 -. -«1;-L1 }

18201120 11501110 12601135 85001460 14601145 26501210 12501115 Примечание.

Продолжение табл 1 Исследованные .имп/мин/г тк селезенка

465143

56156

300i22 202117 I62tl3 382i33 480i33 9816,3 700i59

416143 435±38 510153

208±16 480143 700166

310124 285±26

285121

2201393

2220il93 226±13

Таблица 2 Количество фосфолипидов, холестерина на липосоме соответствует 2 г ткани мозга. Вводят около 1,1 млн. имп/мин внутривенно кроликам, забой через 1ч. Радиоактивность определяют в общей липидной фракции тканей. органы(активность в ани) поджелудочная скелетные железа мышхда Распределение « Распределение Н-цАМФ в органах кролика. (активность в имп/мин/г ткани).(Количество

осом

фосфолифослипид114401970липосом

I ПеченьСкелетные мышцы

Сердце .

140117108t9,3 160120

960i85 22161175

6720±540 1080±110 710223578 н-оуабаина в органах кролика (активность в имп/мин/г ткани). (Ксшичество опытов 3) Таблица 3 Таблица4 опытов 3)