УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЕ ЛИПОСОМЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2013 года по МПК A61K9/127 

Описание патента на изобретение RU2482837C2

Изобретение относится к области молекулярной медицины и фармакологии. Более конкретно, оно относится к липосомам и их использованию в качестве средства доставки для лекарственных соединений. Также предоставлен способ получения липосом.

Лечебные преимущества многих соединений ограничены низким поглощением соединения клетками-мишенями. В общем случае, для максимального лечебного эффекта, необходима доставка соединения к цитоплазматическому или ядерному компартменту клетки, в которых происходят генная транскрипция и трансляция мРНК в белок. Липофильные соединения, включая многие мелкие, незаряженные соединения, могут проникать через клеточную мембрану и делать возможным относительно эффективное поглощение клеткой. Однако для различных более крупных и/или заряженных соединений, таких как белки, нуклеиновые кислоты и хорошо растворимые в воде заряженные органические соединения, пассивное поглощение посредством проникновения через клеточную мембрану ограничено.

Предложено несколько способов для улучшения поглощения перечисленных соединений клетками. Например, лекарственное средство можно вводить в модифицированной форме или в форме пролекарства для транспортировки в клетки и затем подвергнуть ферментативному превращению в активную форму внутри клетки. Однако будет ясно, что получение подходящей формы пролекарства невозможно для всех без исключения лекарственных соединений.

В качестве альтернативы могут быть использованы клеточные процессы фагоцитоза или эндоцитоза, в которых частицы, содержащие лекарственное средство, захватываются клетками-мишенями. В случае доставки частиц большинства современных продаваемых лекарственных средств данный подход, однако, ограничен несколькими типами клеток, например, фагоцитоз ограничен в клетках моноцитарного происхождения и в некоторых других миелоидных клетках, таких как нейтрофилы, в то же время эндоцитоз ограничен в ряде других клеток, среди прочих клетки мезенхимального происхождения, такие как эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки и фибробласты. Следовательно, в отличие от макрофагов и других клеток, которые специализируются на удалении и переработке частиц из крови, существуют много клеток, которые не приспособлены или мало приспособлены к процессированию частиц, содержащих лекарственное вещество.

Другой подход к улучшению поглощения клетками лекарственного средства включает использование фузогенных частиц, предназначенных сливаться с поверхностью мембраны клетки-мишени, высвобождая содержимое частиц в цитоплазматический компартмент клетки. Для данной цели предложены инактивированные и реконструированные вирусные частицы, в частности в генной терапии, когда в клетки вводят крупные цепочки нуклеиновых кислот. Вирусоподобные частицы составлены из вирусных белков, способствующих слиянию, встроенных в искусственный двойной слой липида, представляющих другой пример. Однако проблемы безопасности и издержек, связанные с выращиванием, выделением и дезактивированием вирусных составляющих, ограничивают широкое применение перечисленных подходов.

Эндотелиальные клетки, выстилающие сосудистую стенку всех кровеносных сосудов, представляют собой примеры клеток, которые препятствуют перемещению частиц, содержащих лекарственное средство, например, нагруженных лекарственным средством липосом. Эндотелиальные клетки играют главную роль в гомеостазе всего организма и пато(физио)логии важных заболеваний, включая (хроническое) воспаление и рак. Они также являются заманчивыми клетками-мишенями/тканями-мишенями для доставки лекарственного средства, так как они полностью доступны для любого соединения, переносимого кровью. В добавление, гетерогенность эндотелия в отношении вида и функции позволяет доставку лекарственного средства к конкретной ткани и при конкретном заболевании. Эндотелиальные клетки представляют собой многообещающую цель для лечения рака, так как ангиогенез жизненно необходим для снабжения солидных опухолей кислородом и питательными веществами. Кроме того, при воспалительных заболеваниях они направляют движение лейкоцитов из крови в ткани, и таким образом являются необходимыми для развития заболевания. Авторы настоящего изобретения экспериментально обнаружили, что липосомы, нацеленные на E-селектин или VCAM-1, экспрессированные на TNFα-активированных эндотелиальных клетках, легко подвергаются эндоцитозу в количествах, которые сравнимы со способностью к эндоцитозу макрофагов. Однако, в отличие от макрофагов, эндотелиальные клетки интенсивно не перерабатывают или не разрушают липосомы и, таким образом, накапливают носитель, нагруженный лекарственным средством, внутри везикул. Отсутствие разрушения липосом и/или дестабилизации вызывает сохранение инкапсулированного лекарственного средства в липосоме, соответственно, приводит к низкой фармакологической эффективности.

Следовательно, задача настоящего изобретения состояла в обеспечении средства доставки лекарственного средства на основе липида, которое позволяет улучшить внутриклеточное высвобождение лекарственного средства в клетках-мишенях по сравнению с известными средствами доставки. Еще одна задача предоставить средство доставки лекарственного средства на основе липида для эффективного внутриклеточного высвобождения лекарственного средства в клетках-мишенях, которые не специализированы для удаления и/или переработки частиц на основе липида, таких как эндотелиальные и эпителиальные клетки, мышечные клетки, мозговые клетки, нервные клетки, клетки кожи, волосковые клетки, субпопуляции недифференцированных клеток-предшественников и перицитов, и все другие клетки, не специализированные для переработки носителей для доставки.

Используя способ, который проводит различия между а) липосомальным поглощением клеткой-мишенью и b) высвобождением лекарственного средства из липосомы в клетке-мишени, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что включение искусственного амфифильного производного пиридиния в бислой «классической» или «традиционной» липосомы (например, водный компартмент, окруженный липидным бислоем) дает средство доставки на основе липида, которое обеспечивает эффективную внутриклеточную доставку лекарственного средства в клетках, которые не специализируются на переработке частиц, на основе липида. Только липосомы, включающие бислой, содержащий одно или более искусственных амфифильных производных пиридиния в количестве от 2 до 25% моль, исходя из общего содержания липидов, обнаруживают достаточную стабильность. Соответственно, авторы изобретения предоставляют липосому, содержащую, по меньшей мере, один липидный бислой, включающий водный внутренний компартмент, в которой указанный липидный бислой содержит, по меньшей мере, одно искусственное амфифильное производное пиридиния в количестве от 2 до 25% моль, исходя из общего содержания липидов в липосоме.

Термин «липосома», известный в области техники, относится к водным компартментам, окруженным фосфолипидной двухслойной мембраной. Молекулы фосфолипидов состоят из удлиненной неполярной (гидрофобной) структуры с полярной (гидрофильной) структурой на одном конце. При диспергировании в воде они спонтанно образуют двухслойную мембрану, также называемую ламелла, которая состоит из двух однослойных пластов липидных молекул с неполярными (гидрофобными) поверхностями, обращенными друг к другу и полярными (гидрофильными) поверхностями, обращенными к водной среде.

Амфифильное вещество представляет собой соединение, состоящее из молекул, имеющих полярную растворимую в воде группу, прикрепленную к нерастворимой в воде углеводородной цепочке. Пиридиний относится к катионогенной форме пиридина. Указанная форма может возникать вследствие протонирования кольца азота или добавления заместителя к кольцу азота, обычно алкилированием. Неподеленная пара электронов на атоме азота пиридина не делокализована, и таким образом, пиридин может быть легко протонирован. Выражение «производное пиридиния», как использовано в данном описании, относится к любому амфифильному веществу, имеющему молекулу пиридиния в своей полярной группе.

Искусственные амфифильные производные пиридиния известны в области техники. Особенный интерес для использования в настоящем изобретении представляет собой группа искусственных амфифильных производных пиридиния, предусмотренных технологией Synvolux, SAINT (Synthetic, Amphiphilic, INTeractive). См., например, Европейский Патент EPO 755924-В1. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, одно искусственное амфифильное производное пиридиния выбрано из группы соединений SAINT с общей формулой (I):

в которой

R1 представляет собой (С15)алкил, ар(алкил) или алкильную группу с катионогенной функциональной группой, такой как

или R1 представляет собой (С15 алкилен)R5, в котором R5 представляет собой структуру с общей формулой I, исключая R1;

Х представляет собой галоидный ион, выбранный из Cl-, I-, Br-;

R3 представляет собой водород и R2 и R4 идентичны или различаются, и выбраны из группы, содержащей разветвленный или линейный (С1020)алкил, моно- или полиненасыщенный (С1020)алкенил, О=С-О-алкил,

алкил

или ар(алкил),

или R2 и R4 представляют собой водород и R3 представляет собой -СН(R5)2 с R5, содержащей(С1020)алкил, моно- или полиненасыщенный (С1020)алкенил, О=С-О-алкил,

алкил

или аралкил.

В дополнительном варианте осуществления, в состав включена молекула SAINT, как обозначено выше, к которой не относятся соединения с общей формулой I, в которых R1 представляет собой СН3, R2 и R4 представляют собой водород, R3 представляет собой (C16H33)2CH и Х представляет собой все обозначенные противоионы и не относятся соединения, в которых R1 представляет собой СН3, R2 и R4 представляют собой С16Н33-О-С(О), R3 представляет собой водород и Х представляет собой все обозначенные противоионы.

Липосомы по настоящему изобретению, содержащие молекулу SAINT, также обозначены как «SAINT-о-сомы». Отдельные варианты осуществления настоящего изобретения используют SAINT-18(1-метил-4-(цис-9-диолеил)метилпиридинийхлорид) и/или SAINT-12(1-метил-4-(пентакозан-13-ил)пиридинийхлорид).

Включение искусственных амфифильных производных пиридиния, таких как SAINT, в традиционные липосомы не было описано или предложено в области техники. Однако молекулы SAINT до сих пор использовали в не липосомальных средствах доставки (называемые «липоплексы») для доставки макромолекул, таких как нуклеиновые кислоты или белки к клеткам млекопитающих. EP-A-0755924, например, раскрывает сочетание макромолекулы с SAINT, необязательно в смеси 1:1 со вспомогательным липидом, до образования частицы липоплекса размером до нескольких мкм в диаметре. В липоплексе формируются только нековалентные взаимодействия, представленные между SAINT и макромолекулой. Катионогенные амфифильные вещества на поверхности частицы имеют высокое сродство для отрицательно заряженной поверхности клетки. Поскольку вступительная часть ЕР-А-0755924 относится, вкратце, к «липосомам, которые состоят из двойного слоя фосфолипидов», нужно подчеркнуть, что изобретение, раскрытое в ЕР-А-0755924, точно не относится к указанным липосомам. Скорее, относится к липоплексам, структурная организация которых подробно изучена Oberle et al., используя атомную усилительную микроскопию (2000, Biophysical Journal 79(3), 1447-1454). Фиг.7 Oberle et al. иллюстрирует, что липоплексы, содержащие SAINT, раскрытые, например, в ЕР-А-0755924, состоят из ДНК, завернутой в несколько слоев амфифильного вещества, которые последовательно соединяются в крупный комплекс. Обращает на себя внимание, что некоторые ДНК «торчат» из липоплекса и не защищены от окружающей среды, как будет при включении в состав внутреннего компартмента липосомы, содержащей SAINT, как раскрыто в настоящем изобретении. Rejman et al. (Biochimica et Biophysica Acte 1660 (2004) 41-52), Zuhorn et al. (Biochimica et Biophysica Acta 1560 (2002) 25-36), Van de Woude et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, том 94, стр.1160-1165, 1997) и WO2006/043809 также раскрывает липоплексы, скорее, чем липосомы, содержащие водный внутренний компартмент.

В отличие от вышесказанного, настоящее изобретение относится к липосомам, содержащим водное внутреннее пространство, окруженное двойным слоем липидов, в состав которых включено одно или более искусственных амфифильных производных пиридиния. Без ограничения какой-либо теорией, катионогенная группа пиридиния амфифильного вещества делает липидный бислой липосомы менее ригидным и более склонным к смешиванию (например, сплавлению) с внутриклеточными, эндосомальными мембранными липидами, таким образом, способствуя внутриклеточному высвобождению инкапсулированного соединения. Как демонстрируется в настоящем описании далее, указанный эффект не наблюдается для какого-либо катионогенного амфифильного вещества, так как липосомы с таким же количеством DOTAP (пропан N-[1-(2,3-диолеоилокси)]-N,N,N-триметиламмония), хорошо изученный катионогенный липосомальный переносящий реагент, демонстрируют низкую эффективность.

Липосомы по изобретению имеют одно или более амфифильных производных пиридиния. Точная композиция липосом будет зависеть от отдельных случаев, для которых они используются. Специалист в области техники обычным путем определит подходящую липидную композицию. Общие сведения о липосомах могут быть, например, найдены в Lasic, D.D. «Liposomes: from physics to application», Elsevier Science B.V. Амстердам, 1993 (ISBN 0444895485).

Относительное количество амфифильного производного пиридиния в липосоме согласно изобретению может различаться, но обычно составляет до приблизительно 5-25% моль, исходя из общего количества других липидных составляющих в липосоме. Указанное обстоятельство обеспечивает, то что липосома стабильна снаружи клетки-мишени (например, в токе крови), в то же время позволяет эффективное внутриклеточное высвобождение их инкапсулированного содержимого смешиванием или сливанием с мембраной клетки-мишени. Очень хороший результат получают, если липосомы содержат 5-20% моль, предпочтительно 10-20% моль, например 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20% моль, амфифильного производного пиридиния относительно других использованных липидов. Отдельные варианты осуществления включают липосомы, содержащие 10-20% моль молекул SAINT, например, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 19 или 20% моль SAINT-18 или SAINT-12.

В одном варианте осуществления липосомы согласно настоящему изобретению состоят, главным образом, из липида одного типа в добавление к, по меньшей мере, одному амфифильному производному пиридиния. В предпочтительном варианте осуществления липосомы содержат смесь двух или более липидов, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из глицерофосфолипидов, сфинголипидов и холестерина. Могут быть использованы естественные и/или синтетические липиды. По существу, может быть использован любой тип липида, образующего липосомы или молекулы, в сочетании с, по меньшей мере, одним амфифильным производным пиридиния для получения липосомы по изобретению. Липид, составляющий липосомы согласно настоящему изобретению, включает фосфатидилхолины, фосфатидилэтаноламины, фосфатидные кислоты, ганглиозиды, гликолипиды, фосфатидилглицерины и холестерин. Фосфатидилхолины предпочтительно включают димиристоилфосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин, пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (РОРС) и дистеароилфосфатидилхолин. Фосфатидилэтаноламины предпочтительно включают димиристоилфосфатидилэтаноламин, дипальмитоилфосфатидилэтаноламин и дистеароилфосфатидилэтаноламин. Фосфатидные кислоты предпочтительно включают димиристоилфосфатидную кислоту, дипальмитоилфосфатидную кислоту, дистеароилфосфатидную кислоту и дицетилфосфорную кислоту. Ганглиозиды предпочтительно включают ганглиозид GM1, ганглиозид GD1a и ганглиозид GT1b. Гликолипиды предпочтительно включают галактозилцерамид, глюкозилцерамид, лактозилцерамид, фосфатид и глобозид. Фосфатидилглицерины предпочтительно включают димиристоилфосфатидилглицерин, ди пальмитоилфосфатидилглицерин и дистеароилфосфатидилглицерин.

Исследования in vivo показали, что общепринятые липосомы быстро удаляются из циркуляции клетками ретикулоэндотелиальной системы, т.е. постоянно находящимися в тканях фагоцитами, представленными в ряде органов, в частности в печени и в селезенке. Данное взаимодействие уменьшается при использовании стерически устойчивых липосом, которые могут быть получены включением липидов-производных моносиалоганглиозида (GM1) или поли(этиленгликоля) (PEG) в липидный бислой липосом. Указанные липосомы, покрытые инертными полимерами, демонстрируют существенное увеличение периода полужизни в кровотоке (у человека до порядка дней в отличие от минут для общепринятых липосом).

Стерически устойчивые иммунолипосомы со свойствами специфического клеточного распознавания часто получают соединением антител с дистальными концами цепочек PEG. Использование цепочки PEG в качестве линкера между липосомой и антителом приводит к улучшению распознавания антигена антителом и связыванию, так как антитело не защищено стерической барьерной активностью PEG. Несколько способов ковалентного связывания усовершенствовали для прикрепления (производных) антител к концу PEG. Они используют функционализированные PEG-липиды с химически активной концевой группой, такой как гидразид, N-(3'-(пиридилдитио)пропионат, малеимид, сукцинил, пара-нитрофенилкарбонил или циануровый хлорид. Следовательно, в одном варианте осуществления изобретения производный (например, PEGилированный) фосфолипид может быть использован in vivo для увеличения времени циркулирования липосомальной композиции, и/или позволять соединение белков с поверхностью липосомы. В особом аспекте, липосома согласно настоящему изобретению содержит смесь фосфатидилхолина и холестерина в относительных количествах от 1:1 до 2:1 (% моль), необязательно в смеси с одним или более естественных или искусственных липидов, например, PEGилированным фосфолипидом.

Сама липосома может быть получена любым общепринятым способом, включая тонкопленочный способ, способ выпаривания с обращением фаз, способ впрыска этанола и способ дегидратации/регидратации. Соответственно, изобретение предоставляет способ получения липосомы по изобретению, включающий смешивание общепринятых липидов с подходящим количеством, по меньшей мере, одного синтетического амфифильного производного пиридиния, и получение липосомы соответствующими общепринятыми способами. Также предоставлены липосомы, которые можно получить способом изобретения.

Например, смесь вышеуказанных липидов, из которых удалили растворители, может быть эмульгирована использованием гомогенизатора, лиофилизирована и расплавлена до получения многослойных липосом. В качестве альтернативы, однослойные липосомы могут быть получены способом выпаривания с обращением фаз (Szoka and Papahadjopoulos, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. США 75:4194-4198). Однослойные везикулы могут быть также получены обработкой ультразвуком или экструзией. Обработку ультразвуком в общем случае выполняют ультразвуковым дезинтегратором ванного типа или ультразвуковым дезинтегратором с наконечником Branson при контролируемой температуре, как определено точкой плавления липида.

Вслед за получением липосомы, липосомы, которые не были доведены до требуемого размера во время образования, могут быть доведены до требуемого размера и относительно ограниченного распределения размеров липосом экструзией. Размер частицы липосом может контролироваться способом ультразвукового излучения, способом экструзии, способом френч-пресса, способом гомогенизации или любым другим общепринятым способом.

Экструзия может быть выполнена биомембранным экструдером, таким как Lipex Biomembrane Extruder (Northern Lipids Inc., Ванкувер, Британская Колумбия, Канада). Определенный размер пор в экструзионных фильтрах может приводить к образованию однослойных липосомальных пузырьков определенного размера. Диапазон размера приблизительно 200-400 нм позволит стерилизовать суспензию липосом фильтрацией через общепринятый фильтр (например, фильтр 0,22 микрон). Способ стерилизации фильтрованием может быть выполнен с высокой производительностью. Липосомы могут быть также получены экструзией через асимметричный керамический фильтр, такой как Ceraflow Microfilter (продаваемый из Norton Company, Worcester, Mass.).

Для лечебного применения предпочтительно, чтобы липосома, по изобретению, имела размер (т.е. диаметр) до приблизительно 300 нм. В одном варианте осуществления диапазон размера липосом от приблизительно 20 до 250 нм, предпочтительно 30-200 нм, такой как 50, 60, 75, 100, 120, 135, 150 или 180 нм. В изобретении может быть использован широкий диапазон липосом (включая олиго- или многослойные пузырьки), но предпочтительны маленькие однослойные липосомы (SUV), имеющие наружный диаметр от приблизительно 30 до приблизительно 300 нанометров (нм), наиболее предпочтительно от 50 до 150 нм.

Липосома согласно изобретению может содержать одно или более других подходящих составляющих, например, средства для нацеливания липосомы на специфическую клетку. Сайт-специфическая доставка лекарственных средств к больным клеткам может приводить к увеличению лечебных воздействий и значительному уменьшению токсичности. Нацеливание лекарственного средства конъюгированными антителами липосомами, или иммунолипосомами, представляют технологию, которую применяют для нацеливания лекарственного действия на определенные места, такие как мозг, легкие, раковые клетки, HIV-инфицированные клетки или клетки иммунной системы. Средства липосомального нацеливания, или нацеливающие лиганды, известны в области техники и включают белки, пептиды, такие как антитела или их фрагменты, имеющие специфичность в отношении поверхностного антигена отдельной клетки-мишени или в отношении отдельного внутриклеточного компартмента, такого как митохондрия. Липосомы, на всей поверхности которых представлены антитела против клетки-мишени, относятся в области техники к иммунолипосомам. Сайт-специфическое нацеливание часто опосредовано высоким сродством к связыванию моноклональных антител с их специфическими антигенами. Патент США №5258499 раскрывает композиции средств доставки, содержащие активные вещества, инкапсулированные в липосомальных везикулах, к которым прикреплены белковые гормоны (лиганды), такие как интерлекины-2. Лиганды, способные проявлять сродство к специфическим клеточным рецепторам, обеспечивают доставку инкапсулированного активного средства к клеткам-мишеням, делая возможным доставку активных лекарственных веществ к определенной клеточной популяции при лечении состояний, таких как нарушения иммунной системы. В предпочтительном варианте осуществления липосома несет нацеливающую молекулу, например, лиганд, эндоцитируемый клеткой-мишенью. В еще одном варианте осуществления нацеливающая молекула представляет собой лиганд, который специфически взаимодействует с рецептором тирозинкиназы, таким как, например, рецепторы EGFR, HER2, HER3, HER4, PD-GFR, VEGFR, bFGFR или IGFR. В еще одном варианте осуществления нацеливающая молекула специфически взаимодействует с рецептором фактора роста, рецептором фактора ангиогенеза, рецептором трансферрина, фагоцитарным рецептором, молекулой клеточной адгезии или с рецептором витамина. Примерные специфические к клетке лиганды включают RGD-пептид, NGR-пептид, ATWLPPR-пептид, APRPG-пептид, SMSIARL-пептид, TAASGVRSMH-пептид, LTLRWVGLMS-пептид, CDSDSDITWDQLWDLMK-пептид, GPLPLR-пептид, HWGF-пептид, рекомбинантный VEGF, антитела и моноклональные антитела, биспецифические антитела и одноцепочечные фрагменты против, например, E-селектина, VCAM-1, эндоглина, MHCII, комплекса VEGF:VEGFR, αvβ3, moc-31, cd-90 и других клеточных эпитопов-мишеней. Кроме того, специфический к рецептору лиганд, такой как трансферрин, аполипопротеин Е, лактоферрин, модифицированный альбумин и т.д.

В одном варианте осуществления липосома содержит, по меньшей мере, один нацеливающий лиганд, который связан посредством молекулы-линкера с SAINT-молекулой, включенной в состав липидного бислоя липосом. См., например, молекулы SAINT-линкер-лиганд WO 2006/043811. Предпочтительно, липосома по изобретению содержит немодифицированную (например, не содержащую нацеливающих средств) молекулу SAINT, так же как и SAINT-молекулу, к которой прикреплен через линкер, по меньшей мере, один клеточно- или органоспецифический лиганд.

Ввиду стерического несоответствия относительное количество модифицированных SAINT-молекул относительно немодифицированных SAINT-молекул предпочтительно менее 5%, более предпочтительно менее чем 1%, такое как приблизительно 0,1%. Например, получены липосомы, содержащие в качестве компонентов бислоя 35,8% моль РОРС, 40% моль холестерина, 4% моль PEG-DSPE, 20% моль SAINT C18 и 0,2% моль SAINT С18-линкер.

Как указано выше, липосома согласно изобретению включает внутреннее пространство, которое может быть использовано для доставки одной или более молекул, представляющих интерес, например, биологически активного соединения, к клетке-мишени. Для целей настоящего изобретения термин «биологически активное соединение» предназначен обозначать все встречающиеся в природе или искусственные вещества, способные вызывать биологическую реакцию или иметь влияние, или полезное или повреждающее, включая цитотоксическое, на биологические системы, в частности, на ткани, клетки и клеточные органеллы. Перечисленные соединения предназначены включать все разновидности лекарственных средств, включая антибиотики, антибактериальные, противовирусные, противогрибковые, противовоспалительные, антипролиферативные и противоопухолевые лекарственные средства, и любой ингибитор внутриклеточной сигнальной передачи, разработанный в качестве терапевтического средства, такое как MAPK или SAPK ингибитор; гормоны, включая пептидные гормоны и стероидные гормоны; гены, рекомбинантные нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды или другие нуклеиновые кислоты, кодирующие все или часть генов млекопитающих, включая специализированную малую интерферирующую РНК (также известную как короткая интерферирующая РНК или siPHK) и специально созданные молекулы короткой РНК, которые могут эффективно подавлять действие микроРНК в регуляции экспрессии генов, таких как антагомиры, вирусные гены или гены из микроорганизмов; антигены; ферменты; питательные вещества; и наиболее особенным образом, какое-либо биологически активное соединение, которое неспособно поглощаться посредством пассивного проникновения через клеточную мембрану интересующей клетки-мишени. В одном аспекте липосома содержит во внутреннем компартменте биологически активное соединение, имеющее нейтральный или положительный суммарный заряд, например, белковое вещество.

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к композициям, содержащим липосому по изобретению. В общем случае липосомальная композиция настоящего изобретения достаточно стабильна во время хранения, что измеряют, например, определением процента от захваченного вещества снаружи липосом или вещества, еще сохраненного внутри липосом, от исходно загруженного вещества внутри липосом по настоящему изобретению после некоторого периода времени. Например, липосомальная композиция согласно настоящему изобретению устойчива при 4ºС в течение, по меньшей мере, 6 месяцев, менее чем 10% захваченного вещества высвобождаются через 6 месяцев после исходной загрузки вещества. В одном варианте изобретения липосомальная композиция согласно настоящему изобретению устойчива при 4ºС в течение, по меньшей мере, 2 лет, менее чем 20% захваченного вещества высвобождаются через 2 года после исходной загрузки вещества.

В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, липосомальная композиция настоящего изобретения может быть предоставлена в виде фармацевтической композиции, содержащей липосомальную композицию согласно настоящему изобретению и носитель, например, фармацевтически приемлемый носитель. Примеры фармацевтически приемлемых носителей представляют собой физиологический раствор, изотоническую декстрозу, изотоническую сукрозу, раствор Рингера и раствор Ханкса. Может быть добавлено буферное вещество для обеспечения рН, оптимального для устойчивости при хранении. Например, рН от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,5, более предпочтительно рН приблизительно 6,5, оптимально для стабильности липидов мембраны липосомы и обеспечивает превосходное удержание инкапсулированных веществ. Гистидин, гидроксиэтилпиперазин-этилсульфонат (HEPES), морфолипо-этилсульфонат (MES), сукцинат, тартрат и цитрат, обычно в концентрации 2-20 мМ, представляют собой типичные буферные вещества. Другие типичные носители включают, например, воду, водный раствор с буферной добавкой, 0,4% NaCl, 0,3% глицин и т.п. Могут быть добавлены белковые, углеводные или полимерные стабилизаторы и регуляторы тоничности, например, желатин, альбумин, декстран или поливинилпирролидон. Тоничность композиции может быть скорректирована до физиологического уровня 0,25-0,35 моль/кг глюкозой или более инертным соединением, таким как лактоза, сукроза, маннит или декстрин. Данные композиции могут быть стерилизованы общепринятыми, хорошо известными способами стерилизации, например, фильтрацией. Полученные водные растворы могут быть упакованы для использования или профильтрованы в асептических условиях и лиофилизированы, лиофилизированную композицию сочетают со стерильной водной средой перед введением.

Фармацевтические липосомальные композиции могут также содержать другие фармацевтические вспомогательные вещества, в соответствии с приблизительными физиологическими условиями, такие как регуляторы рН и буферные вещества, вещества, регулирующие тоничность и т.п., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция и т.п. Дополнительно липосомальная суспензия может содержать вещества, защищающие липиды, которые защищают липиды от повреждения свободными радикалами и липопироксидами при хранении. Подходят липофильные свободно-радикальные гасители, такие как альфа-токоферол и водорастворимые железоспецифические хелаторы, такие как ферриоксамин.

Концентрация липосом по настоящему изобретению в жидких фармацевтических композициях может очень различаться, т.е. от менее чем приблизительно 0,05% обычно или, по меньшей мере, приблизительно 2-10% вплоть до от 30 до 50% масс. и будет определяться в первую очередь объемами жидкости, вязкостями, и т.п., в соответствии с отдельным выбранным способом введения. Например, концентрация может быть повышена с целью снижения содержания жидкости, связанного с лечением. Это может быть особенно необходимо у пациентов, имеющих застойную сердечную недостаточность, связанную с атеросклерозом или тяжелой артериальной гипертензией. С другой стороны, липосомальные фармацевтические композиции, состоящие из липидов, вызывающих раздражение, могут быть разбавлены до низких концентраций для уменьшения воспаления в месте введения.

Количество введенной липосомальной фармацевтической композиции будет зависеть от нескольких факторов, например, от отдельного лекарственного вещества, заключенного в липосомах, болезненного состояния, подвергаемого лечению, типа использованных липосом и/или решения клинициста. В общем случае, количество введенной липосомальной фармацевтической композиции будет достаточно для доставки отдельного лекарственного вещества в терапевтически эффективной дозе.

Количество липосомальной фармацевтической композиции, необходимое для доставки терапевтически эффективной дозы, может быть определено способами in vivo и in vitro, общими в области исследования лекарственных средств. См., например, D.B. Budman, A.H. Calvert, E.K. Rowinsky (редакторы). Handbook of Anticancer Drug Development, LWW, 2003. Терапевтически эффективные дозировки для различных лекарственных средств хорошо известны специалистам в области техники; и, в соответствии с настоящим изобретением, лекарственное средство, доставленное с помощью фармацевтической липосомальной композиции согласно настоящему изобретению, предоставляет, по меньшей мере, или 2-, 4- или 10-кратное увеличение активности по сравнению с активностью, полученной введением такого же количества лекарственного средства в общепринятой липосомальной композиции, не содержащей, по меньшей мере, одного амфифильного производного пиридиния. Обычно дозы для липосомальной фармацевтической композиции настоящего изобретения составляют от приблизительно 0,005 до приблизительно 500 мг лекарственного средства на килограмм массы тела, наиболее часто, от приблизительно 0,1 до приблизительно 100 мг лекарственного средства/кг массы тела или массы органа-мишени.

В одном варианте осуществления фармацевтическую липосомальную композицию согласно настоящему изобретению получают в виде композиции для местного или инъекционного введения, или в виде жидкого раствора или суспензии. Однако могут быть получены твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекционным введением. Композиция также может быть сформована в таблетку с кишечнорастворимым покрытием или гельную капсулу, в соответствие со способами, известными в данной области.

Липосомальная композиция согласно настоящему изобретению может быть введена любым подходящим с медицинской точки зрения способом, который может зависеть от состояния или заболевания, которое подвергают лечению. Возможные пути введения включают инъекции, парентеральные пути, такие как внутримышечный, подкожный, внутривенный, внутриартериальный, внутрибрюшинный, внутрисуставной, эпидуральный, интратекальный, или другие, такие как пероральный, назальный, глазной, ректальный, вагинальный, местный или легочный, например, ингаляцией. Для доставки лекарственных средств, заключенных в липосомы, полученные согласно изобретению, к опухолям центральной нервной системы, особенно успешна медленная, непрерывная внутричерепная инфузия липосом непосредственно в опухоль (конвекционная усовершенствованная доставка или CED). См. Saito, et al., Cancer Research, том 64 стр.2572-2579, 2004; Mamot et al., J. Neurooncology, том 68, стр.1-9, 2004. Композиции могут быть также непосредственно нанесены на поверхность ткани. Введение композиций с замедленным высвобождением, с зависимым от рН высвобождением или с другим высвобождением, опосредованным специфическим химическим состоянием или условиями окружающей среды, также особенным образом включено в изобретение, например, такими способами, как инъекции веществ замедленного всасывания или эрозионные импланты.

Желательно, чтобы средний диаметр частиц составлял 400 нм или менее в случае внутривенного введения. Это обусловлено тем, что липосома, имеющая размер частицы, превосходящий 400 нм, задерживается в печени, селезенке и других органах эндотелиальной системы и легкими.

Также предоставлен способ облегчения доставки биологически активного соединения к клетке-мишени, которая не специализирована для удаления и переработки частиц из крови, включающий внутривенное введение липосомы по изобретению, которая содержит биологически активное соединение. Дополнительный аспект относится к использованию липосомы по изобретению в качестве средства доставки целевого вещества внутрь клетки-мишени in vitro и in vivo, которая не специализирована для удаления и/или переработки частиц, на основе липидов. Предпочтительно, указанная клетка-мишень выбрана из группы, состоящей из эндотелиальных клеток, эпителиальных клеток, мышечных клеток, клеток мозга, нервных клеток, клеток кожи, волосковых клеток, субпопуляции недифференцированных клеток-предшественников и перицитов. Более предпочтительно, клетка-мишень представляет собой эндотелиальную клетку. Липосома и способ доставки, на основе липосом по изобретению, например, облегчает (направленную) доставку биологически активного соединения к эндотелиальным клеткам, например, TNFα-активированным эндотелиальным клеткам. Таким образом, липосома, раскрытая в настоящем описании, успешно используется в качестве средства доставки лекарственного средства.

Также предоставлено использование липосомы по изобретению, содержащей, по меньшей мере, одно биологически активное соединение, или во внутреннем пространстве, и/или включенное в липидный бислой, и/или прикрепленное ковалентно или другим образом к одному из компонентов липосомы, для получения лекарственного средства для лечения рака, хронического воспаления, тканевого восстановления/регенерации, диабета или метаболического заболевания, связанного с клеточной дисфункцией.

В одном варианте осуществления липосому, предоставленную способами нацеливания EPCAM и инкапсулированием цитостатического соединения, используют для получения лекарственного средства для лечения рака. В другом варианте осуществления липосому, предоставленную способами нацеливания E-селектином и содержащую р38МАРК ингибитор, используют для получения лекарственного средства для лечения гломерулонефрита или ревматизма.

НАДПИСИ К ЧЕРТЕЖАМ

Фиг.1А: Внутриклеточную переработку иммунолипосом против Е-селектина в HUVEC, нацеленных на Е-селектин (HES) или VCAM-1 (VCAM) изучали, используя двойные общепринятые липосомы, меченные изотопами, т.е. без искусственного амфифильного производного пиридиния, содержащие разрушающийся в процессе метаболизма сложный эфир холестерил [14С]олеат в добавление к неразрушающемуся простому эфиру [3Н]холестерилолеилу. В случае ненарушенного метаболизма, после эндоцитоза холестериловый эфир гидролизуется и освобожденная [14С]олеиновая кислота будет высвобождаться из клеток в культуральную среду. [3Н] холестерилолеиловый простой эфир остается связанным и, следовательно, 3Н/14С соотношение представляет собой подходящую оценку разрушения липосом [5]. Как продемонстрировано на панели А, 3Н/14С соотношение не изменяется при продленной инкубации, выявляя отсутствие гидролиза холестерил-[14С]олеата. Даже 24-часовая инкубация не приводит к какому-либо существенному гидролизу двойных общепринятых иммунолипосом против Е-селектина. На панели В сравнивают разрушение иммунолипосом HUVEC с разрушением аналогичных липосом клетками IC21 (перитонеальными макрофагами). Продемонстрировано, что аналогичные липосомы могут эффективно разрушаться специализированными клетками. Инкубации в присутствии ингибиторов (хлорохин, NH4Cl) лизосомального разрушения выявляют, что разрушение является лизосомальным (данные не показаны).

Фиг.2: TNFα активированные HUVEC инкубируют в течение 24 часов с иммунолипосомами против Е-селектина (в отсутствие искусственного амфифильного производного пиридиния), флуоресцентно меченным маркером липидного бислоя DiI. Липосомы накопились в определенных внутриклеточных везикулах, в то же время не выявлено перераспределения флуоресцентной метки через клеточные мембраны, т.е. липосомы не разрушались после эндоцитоза эндотелиальными клетками.

Фиг.3: Липосомы по изобретению получают, как описано в общем способе, и так, чтобы они содержали указанное количество искусственного амфифильного производного пиридиния (в случае SAINT-18) или упомянутого катионогенного амфифильного вещества DONAP. Липосомы хранят при 4°С в аргоне в течение определенных периодов времени. Размер частиц липосом измеряют в определенное время динамическим рассеиванием света, используя анализатор субмикронных частиц Nicomp модель 380 в режиме объемного взвешивания. Данные представлены в виде единого значения для 1, или среднего значения ±SD от 2 до 5 независимых липосомальных композиций.

Фиг.4: Липосомы получают, как описано в общем способе. Липосомы хранят в термостатированной водяной ванне при 37°С или на лабораторном столе при комнатной температуре (20°С) в отсутствие (панель А) или в присутствии (панель В) 10% (об./об.) сыворотки. Размер частиц анализируют в определенное время динамическим рассеиванием света, используя анализатор субмикронных частиц Nicomp модель 380 в режиме объемного взвешивания. Данные представлены в виде среднего значения ±SD от 3 или 4 независимых липосомальных композиций.

Фиг.5: Липосомы получают, как описано, с увеличивающимися количествами амфифильного производного пиридиния. Размер липосом совершенно устойчив, если бислой получен с использованием SAINT C18 0-20% моль. Приблизительно свыше 20-25% моль амфифильного производного пиридиния, липосомы начинают терять устойчивость размера.

Фиг.6: Кальцеин высвобождается из липосом в зависимости от рН. Флуоресценцию липосом мониторируют во время инкубации в буферных растворах с определенной рН в 96-ячейковых планшетах в стандартном флуориметре. Высвобождение кальцеина сравнивают с общей флуоресценцией липосом, измеренной после обработки Triton-X100. Данные представляют в виде относительного высвобождения по сравнению с липосомами, полученными без использования SAINT или DOTAP (среднее значение ±SD от 3 или 4 независимых липосомальных композиций).

Фиг.7: Высвобождение кальцеина из липосом, полученных с использованием 20% моль SAINT или DOTAP при рН 7,4 и рН 5. Флуоресценцию липосом мониторируют во время инкубации в буферных растворах с определенной рН в 96-ячейковых планшетах в стандартном флуориметре. Высвобождение кальцеина сравнивают с общей флуоресценцией липосом, измеренной после обработки Triton-X100. Данные представляют в виде относительного высвобождения по сравнению с липосомами, полученными без использования SAINT или DOTAP (среднее значение ±SD от 3 или 4 независимых липосомальных композиций). *р<0,005 по сравнению с рН 7,4; # р<0,05 по сравнению с липосомами, содержащими 20% моль SAINT.

Фиг.8: Влияние 10% сыворотки (об./об.) на высвобождение кальцеина из липосом. Флуоресценцию липосом мониторируют в 96-ячейковых планшетах в стандартном флуориметре. Высвобождение кальцеина вычисляют после определения общей флуоресценции липосом, измеренной после обработки Triton-X100. Данные представляют в виде относительного высвобождения по сравнению с липосомами, полученными без использования SAINT или DOTAP (среднее значение ±SD от 3 или 4 независимых экспериментов).

Фиг.9: TNFα активированные HUVEC инкубируют в течение 24 часов с иммунолипосомами, содержащими кальцеин. Панель А: иммунолипосомы против Е-селектина, полученные с использованием 20% моль SAINT. Панель В: иммунолипосомы против Е-селектина, не содержащие SAINT. Панель С: ненацеленные липосомы с 20% моль SAINT. Высвобождение кальцеина наиболее заметно с нацеленными липосомами, которые содержат SAINT.

Фиг.10: Поглощение DiI (панель А) и кальцеина (панель В) мечеными липосомами HUVEC. Не стимулированные и стимулированные TNFα клетки инкубируют с указанными липосомами в течение 3 часов. Поглощение липосом исследуют FACS. Данные представлены для трех независимых экспериментов.

Фиг.11: Влияние липосом, нацеленных на Е-селектин, полученных с использованием 20% моль SAINT, содержащих интерлейкин-8 (IL-8) siPHK, на экспрессию IL-8 в условно иммортализированных гломерулярных эндотелиальных клетках человека (ciGEnc). TNF-α активированные ciGEnc инкубируют с SAINT иммунолипосомами к Е-селектину, содержащими siPHK (или специфическими для IL-8 или зашифрованными siPHK) в течение 48 часов. Подавление экспрессии IL-8 исследуют ПЦР в реальном времени. Представленные данные получают из одного эксперимента.

Фиг.12: Понижающая регуляция экспрессии VE-кадгерина Фиг.11: Влияние липосом, нацеленных на Е-селектин, полученных с использованием 20% моль SAINT и содержащих siPHK на среднем Т-антигене клеточной линии H5V полиомы, трансформированной онкогеном эндотелиомы. Е-селектиновые SAINT-о-сомы, содержащие специфическую siPHK для VE-кадгерина и закодированную siPHK, инкубируют с клетками H5V при концентрации siPHK 1000 пмоль/мл в течение 48 часов. Влияния siPHK исследуют ПЦР в реальном времени. Экспрессию VE-кадгерина в клетках, обработанных липосомами, сравнивают с клетками, обработанными TNF-α (произвольно до 1). Данные представлены в виде среднее значение ±SD.

ПРИМЕРЫ

Использованные аббревиатуры:

TNFα, фактор некроза опухоли α

VCAM-1, молекула сосудистой клеточной адгезии 1

HUVEC, эндотелиальные клетки пупочной вены человека

DiI, 1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат

SAINT, хлорид N-метил-4-алкилпиридиния; SATA, (N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат)

DOTAP, N-[1-(2,3-диолеоилокси)]-N,N,N-триметиламмоний пропан

Липосомальные композиции

Липосомы получили в соответствии с приведенным далее. Липиды из исходных растворов 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (РОРС), холестерина (Chol), 2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (DSPE-PEG) и 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000]-малеимида (DSPE-PEG-Mal) в смеси хлороформ:метанол (объем 9:1) смешивают в молярном соотношении 55:40:4:1, сушат при пониженном давлении в азоте, растворяют в циклодекстране и подвергают сублимационной сушке. Если указано, добавляют 1-метил-4-(цис-9-диолеил)метил-пиридиний-хлорид (SAINT-18) к липидной смеси в определенном молярном %, всегда за счет количества РОРС. При необходимости к композиции добавляют следовые количества [3Н]холестерилолеилового простого эфира и холестерил-[14C]-олеата, в качестве неразрушающегося маркера и разрушающегося маркера, соответственно. Для флуоресцентной микроскопии и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии 0,5% моль DiI добавляют к липидной смеси, как указано. Липиды затем гидратируют в буфере Hepes (10 мМ N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота (Hepes), 135 мМ NaCl, рН6,7) или в водном растворе, содержащем 100 мМ кальцеина. Полученные липосомы доводят до требуемого размера повторяющейся экструзией (13 раз) через поликарбонатные фильтры (Costar, Кембридж МА, США), размер пор 50 нм, используя экструдер высокого давления (Lipex, Ванкувер, Канада).

Моноклональное мышиное анти-человеческое Е-селектиновое антитело (Н 18/7, любезно предоставленное др. М.Gimbrone, jr., Бостон, МА, США) тиолируют N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетатом и присоединяют к малеимидной группе на дистальном конце цепочки полиэтиленгликоля методикой сульфгидрил-малеимид соединения [2], в точности как описано выше для альбумина [3]. Контрольные иммунолипосомы получают, как описано ранее, используя иррелевантный крысиный IgG (Sigma-Aldrich Chemie, Zwijndrecht, Нидерланды). Контрольные липосомы без антител получают из аналогичной липидной смеси, но вместо инкубации с антителами, их инкубируют с цистеином в двойном молярном количестве DSPE-PEG-Mal до блокирования реакционных малеимидогрупп. Иммунолипосомы характеризуют определяющим белком, используя мышиный иммуноглобулин G в качестве стандарта 4 и содержание фосфора фосфолипидов 5. Общие концентрации липидов липосом корректируют в отношении количества холестерина и SAINT, представленных в композициях липосом.

Размер частиц анализируют динамическим рассеиванием света, используя анализатор субмикронных частиц Nicomp модель 380 в режиме объемного взвешивания (системы измерения размера частиц NICOMP, Санта-Барбара, Калифорния, США).

Клеточное нацеливание

HUVEC активируют TNFα в течение определенного времени. Липосомы, или меченые изотопом, или флуоресцентно меченные, добавляют к клеткам в течение определенного периода времени. Для анализа клеточного связывания липосом, меченных изотопом, клетки помещают на лед в конце инкубации, среду удаляют и клетки промывают 5 раз PBS. Клетки затем лизируют и определяют радиоактивность жидкостно-сцинтиляционным измерением активности. Для флуоресцентной микроскопии и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии инкубацию выполняют, как описано выше. Микроскопию выполняют в течение 1 часа после завершения инкубации. Во время указанного периода времени отсутствуют изменения в морфологии клетки и изображения подобных инкубаций воспроизводимо во время данного периода.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Иммунолипосомы, нацеленные на Е-селектин или VCAM-1 на активированных TNFα эндотелиальных клетках, легко подвергаются эндоцитозу в количествах, сравнимых со способностью к эндоцитозу макрофагов. Однако, в отличие от макрофагов, эндотелиальные клетки не перерабатывают (не разрушают) липосомы (фиг.1) и накапливают их внутри везикул (фиг.2). Отсутствие разрушения липосом и/или дестабилизации приводит к удержанию лекарственных средств внутри липосомы и, следовательно, к снижению фармакологической эффективности.

Липосомы, полученные с использованием увеличивающегося % моль SAINT, стабильны по размеру в течение периода свыше 2 месяцев, при хранении в аргоне при 4°С. Композиции липосом, содержащие SAINT, вызывают незначительное увеличение диаметра частиц с 90 нм для липосом, не содержащих SAINT, до 130 нм для липосом, полученных с использованием 20% моль SAINT (фиг.3). Результаты сравнили с липосомами, полученными с использованием 20% моль DOTAP, непиридиниевого катионогенного липида, часто используемого в средствах доставки нуклеотидов на основе липидов.

Липосомы, полученные с использованием SAINT, также демонстрируют устойчивость размера при 37ºС в течение, по меньшей мере, 24 часов (фиг.4А). При инкубации в присутствии 10% (об./об.) серы увеличивается размер липосом после 7 часов инкубации, особенно при комнатной температуре (фиг.4В). Однако при физиологической температуре 37°С увеличение диаметра спустя 24 ч инкубации было очень ограниченным для липосом, полученных с использованием искусственного амфифильного производного пиридиния. Для липосом, полученных с использованием 20% моль SAINT, средний диаметр увеличивался до 130 нм по сравнению с временем 0.

Как следует из фиг.5, липосомы, полученные с использованием до 20% моль амфифильного производного пиридиния, сохраняют стабильность размера. Увеличение количества приводит к уменьшению стабильности, увеличение до 30% моль вызывает образование гигантских, слившихся частиц, имеющих диаметр приблизительно 500 нм.

Высвобождение содержимого липосом определяют, используя кальцеин в качестве модели для растворимого в воде инкапсулированного соединения. Флуоресценцию кальцеина гасят при концентрации, в которой он инкапсулирован внутри липосом (100 мМ). При разведении кальцеин флуоресцирует. Это позволяет различать инкапсулированный кальцеин (без флюоресценции) от высвобожденного кальцеина. Путь эндоцитоза, которым (иммуно)липосомы вовлекаются во внутриклеточный транспорт через эндосомы, происходит при снижении рН. Таким образом, высвобождение кальцеина из липосом, полученных с использованием возрастающих количеств искусственного амфифильного производного пиридиния, определяют как функцию рН (см. фиг.6). Удержание кальцеина в липосомах, полученных с использованием SAINT, устойчиво при нейтральной рН. При рН ниже 6 высвобождение кальцеина увеличивается, если липосомы имеют в своем составе 20% моль SAINT, демонстрируя наибольшее высвобождение в диапазоне рН 4,5-6. Липосомы, полученные с использованием 20% моль DOTAP, демонстрируют меньшую вариабельность характера высвобождения (фиг.6). В фиг.7 особенности высвобождения для липосом, полученных с использованием 20% моль SAINT, сравнивают при рН 7,4 и рН 5 (релевантная рН относительно к рН в эндосомах). При рН 5 значительно увеличивается высвобождение кальцеина из липосом. Дополнительно, высвобождение из SAINT липосом при данной рН лучше, чем из липосом, полученных с использованием DOTAP.

Добавление 10% сыворотки к липосомам, полученным с использованием SAINT, приводит к увеличению со временем высвобождения кальцеина для липосом, содержащим 10% моль SAINT (фиг.8).

Далее, изучено высвобождение кальцеина in vitro из липосом. Эндотелиальные клетки, HUVEC, активируют TNFα и инкубируют с (а) иммунолипосомами против Е-селектина, полученными с использованием 20% моль SAINT, (b) контрольными иммунолипосомами против E-селектина, не содержащими SAINT, или (с) липосомами (не содержащими анти-Е-селектин), полученными с использованием 20% моль SAINT. Фиг.9 ясно демонстрирует, что клетки, инкубированные с иммунолипосомами, полученными с использованием 20% моль SAINT, проявляют наибольшую кальцеиновую флуоресценцию, выявляя предпочтительное внутриклеточное высвобождение флуорофора из SAINT липосом, которые захвачены клетками. Поглощение иммунолипосом против Е-селектина не зависит от включения в их состав SAINT (определяют FACS, используя DiI в качестве маркера, см. фиг.10), следовательно, количество поглощенных липосом в фиг.9А и фиг.9В одинаково. Липосомы, полученные с использованием SAINT, но без использования способов клеточного нацеливания, поглощаются в меньшей степени (фиг.9С).

Результат, продемонстрированный на фиг.9, подтверждают в краткосрочных инкубациях с липосомами, которые мечены двойной меткой DiI в качестве липидной метки и кальцеином в качестве инкапсулированной метки. HUVEC, который активируют в течение 4 ч TNFα, инкубируют в течение 5, 15, 30 или 60 минут с иммунолипосомами против Е-селектина, не содержащими SAINT или полученными с использованием 20% моль SAINT. В клетках, инкубированных с липосомами, не содержащими SAINT, исходно красная флуоресценция наблюдается во всех временных точках. В противоположность, в клетках, инкубированных с липосомами, полученными с использованием SAINT, кроме красной флуоресценции наблюдается также и желтая флюоресценция в ранние сроки. Желтая флуоресценция выявляет высвобождение кальцеина, флюоресценция которого со-локализована с липосомами. На 30 и 60 минутах также видима зеленая флуоресценция, выявляющая различное внутриклеточное накопление содержимого липосом, по сравнению с самими липосомами (данные не показаны).

Поглощение липосом и высвобождение инкапсулированного кальцеина из липосом определяют (полу)количественным способом, используя FACS. Поглощение липосом, нацеленных Е-селектином, HUVEC, активированными TNFα, сравнивают для липосом, которые получают с использованием 20% моль SAINT, и для липосом, не содержащих SAINT, как определяют измерением средней интенсивности флуоресценции (произвольные единицы) липосомального DiI (фиг.10А). Высвобождение кальцеина из липосом, нацеленных на Е-селектин, полученных с использованием 20% моль SAINT, однако, выше в 8-10 раз по сравнению с липосомами, не содержащими SAINT (фиг.10В).

Липосомы, нацеленные на Е-селектин, полученные с использованием 20% моль SAINT, содержащие специфическую siPHK, были очень эффективны в отрицательной регуляции генов-мишеней (фиг.11 и 12). В активированных TNFα эндотелиальных клетках клубочков нацеленные на Е-селектин липосомы, полученные с использованием 20% моль SAINT и содержащие siPHK против интерлейкина-8 (IL-8), подавляют экспрессию IL-8 почти в 60%, в то же время отсутствует эффект липосом, полученных без SAINT или липосом, содержащих контрольную (закодированную) siPHK (фиг.11). То же самое относится к экспрессии VE-кадгерина, который может быть эффективно ингибирован более чем на 60%, используя липосомы, нацеленные на Е-селектин, полученные с использованием 20% моль SAINT, в эндотелиальной мышиной клеточной линии.

ССЫЛКИ

Похожие патенты RU2482837C2

название год авторы номер документа
ЛИПОСОМНЫЕ КОМПОЗИЦИИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ 2015
  • Хонг Килунг
  • Дрюммонд Дэрил С.
  • Кирпотин Дмитрий В.
RU2757110C2
ЛИПОСОМНЫЕ КОМПОЗИЦИИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ 2005
  • Хонг Килунг
  • Дрюммонд Дэрил С.
  • Кирпотин Дмитрий В.
RU2574926C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПИДНЫХ НАНОЧАСТИЦ ДЛЯ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА 2012
  • Кнопов Виктор
  • Витте Ричард П.
  • Кармали Прия
  • Ли Робин
  • Вебб Дэвид
  • Акопян Виолетта
RU2647476C2
СПОСОБ ДОСТАВКИ БОРСОДЕРЖАЩИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ БОР-НЕЙТРОНОЗАХВАТНОЙ ТЕРАПИИ 2014
  • Таскаев Сергей Юрьевич
  • Каныгин Владимир Владимирович
  • Мухамадияров Ринат Авхадиевич
  • Кичигин Александр Иванович
RU2589822C2
ЛИПОСОМАЛЬНЫЕ КОМПОЗИЦИИ И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ ТВЕРДЫЕ ПЕРОРАЛЬНЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ФОРМЫ 2018
  • Уль, Филипп
  • Заутер, Макс
  • Мир, Вальтер
RU2751192C2
СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ НАЦЕЛЕННОЙ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА И УСИЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ siPHK 2012
  • Шридхар К. Нэгэрайян
  • Кармэли Прия
  • Ниитсу Йоширо
  • Пейн Джозеф И.
  • Хоу Дзенг
  • Гаудетте Джон А.
  • Кнопов Виктор
  • Уитт Ричард П.
  • Ахмадиан Мухаммед
  • Перельман Лорен А.
  • Танака Ясунобу
  • Акопян Виолетта
RU2632888C2
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ УПРАВЛЯЕМОГО ВЫСВОБОЖДЕНИЯ СЛАБОКИСЛОТНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ 2019
  • Кань, Пей
  • Линь, И Фон
  • Чэнь, Кочиэй
RU2810790C2
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ НИОСОМАЛЬНЫЙ ГЕЛЬ НА ОСНОВЕ ВЕЩЕСТВА N-гидрокси-2-(2-(нафтален-2-ил)-1H-индол-3-ил)-2-фенилацетамид С ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ К ГЛИОБЛАСТОМЕ 2015
  • Базиков Игорь Александрович
  • Аксёнов Александр Викторович
  • Аксёнов Николай Александрович
  • Мальцев Александр Николаевич
  • Смирнов Александр Николаевич
RU2627449C2
ЛИПОСОМАЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ПЕРИТОНЕАЛЬНОМ ДИАЛИЗЕ 2013
  • Леру Жан-Кристоф
  • Форстер Винсент
RU2609860C2
СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОПУХОЛИ И НАБОР, СОДЕРЖАЩИЙ ЛИПОСОМАЛЬНУЮ КОМПОЗИЦИЮ ГЕМЦИТАБИНА 2016
  • Китахаси, Цукаса
  • Мима, Синдзи
  • Мацумото, Такеси
  • Секигути, Такахиро
  • Мори, Микинага
RU2761620C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 482 837 C2

Реферат патента 2013 года УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЕ ЛИПОСОМЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области молекулярной медицины и фармакологии и описывает липосому, содержащую, по меньшей мере, один липидный бислой, окружающий водный компартмент, в которой указанный липидный бислой содержит, по меньшей мере, одно амфифильное синтетическое производное пиридиния, в котором общее количество амфифильного производного пиридиния составляет от 2 до 25% моль, исходя из общего содержания липидов в липосоме. Липосомы пригодны для доставки лекарственных соединений. Липосома является стабильной и позволяет улучшить внутриклеточное высвобождение лекарственного средства. 6 н. и 12 з.п. ф-лы, 1 пр., 12 ил.

Формула изобретения RU 2 482 837 C2

1. Липосома, содержащая, по меньшей мере, один липидный бислой, окружающий водный компартмент, в которой указанный липидный бислой содержит, по меньшей мере, одно амфифильное синтетическое производное пиридиния, в котором общее количество амфифильного производного пиридиния составляет от 2 до 25 мол.%, исходя из общего содержания липидов в липосоме.

2. Липосома по п.1, в которой общее количество амфифильного производного пиридиния составляет от 5 до 20 мол.%.

3. Липосома по п.2, в которой общее количество амфифильного производного пиридиния составляет 10-20 мол.%.

4. Липосома по п.1 или 2, имеющая наружный диаметр от приблизительно 30 до приблизительно 300 нанометров (нм), наиболее предпочтительно от 50 до 150 нм.

5. Липосома по п.1, в которой, по меньшей мере, одно указанное искусственное амфифильное производное пиридиния представляет собой SAINT-молекулу, предпочтительно SAINT-молекулу, выбранную из группы SAINT соединений общей формулы (I):

в которой R1 представляет собой (С15)алкил, ар(алкил) или алкильную группу с катионогенной функциональной группой, такой как

или R1 представляет собой (С15 алкилен)R5, в котором R5 представляет собой структуру с общей формулой I, исключая R1;
Х представляет собой галоидный ион, выбранный из Cl-, I-, Br-;
R3 представляет собой водород и R2 и R4 идентичны или различаются, и выбраны из группы, содержащей разветвленный или линейный (С1020)алкил, моно- или полиненасыщенный (С1020)алкенил, O=С-O-алкил,

или ар(алкил),
или R2 и R4 представляют собой водород, и R3 представляет собой -CH(R5)2 с R5 содержащей(С1020)алкил, моно- или полиненасыщенный (С1020)алкенил, O=С-O-алкил,

или аралкил; или
из группы SAINT соединений вышеуказанной формулы (I), за исключением соединений, в которых R1 представляет собой СН3, R2 и R4 представляют собой водород, R3 представляет собой (С16Н33)2СН, и Х представляет собой все обозначенные противоионы, и за исключением соединений, в которых R1 представляет собой СН3, R2 и R4 представляют собой С16Н33-O-С(O), R3 представляет собой водород, и Х представляет собой все обозначенные противоионы.

6. Липосома по п.4, содержащая SAINT-18 (1-метил-4-(цис-9-диолеил)метилпиридинийхлорид) и/или SAINT-12 (1-метил-4-(пентакозан-13-ил)пиридинийхлорид).

7. Липосома по п.1, стерически стабилизированная, предпочтительно включением моносиалоганглиозидного (GM1) и/или поли(этиленгликольного) (PEG) производного липида в липидный бислой.

8. Липосома по п.1, содержащая на своей поверхности, по меньшей мере, одно нацеливающее средство, способное распознавать и связываться с поверхностной молекулой отдельной клетки-мишени или внутриклеточным компартментом клетки-мишени.

9. Липосома по п.8, в которой указанные нацеливающие средства обладают специфичностью для поверхности клетки-мишени, которая не специализирована для удаления и переработки частиц, предпочтительно для эндотелиальной клетки.

10. Липосома по п.1, в которой указанные нацеливающие средства представляют собой RGD-пептидное звено, антитело против Е-селектина или антитело против VCAM-1.

11. Липосома по п.1, в которой указанное, по меньшей мере, одно нацеливающее средство связано через линкер с SAINT-молекулой, включенной в липидный бислой.

12. Липосома по п.1, содержащая в своем внутреннем компартменте и/или связанная своим липидным бислоем, по меньшей мере, с одним биологически активным соединением.

13. Липосома по п.12, в которой указанное биологически активное соединение выбрано из группы, состоящей из антибиотиков, антибактериальных, противовирусных, противогрибковых, противовоспалительных, антипролиферативных и противоопухолевых лекарственных средств; гормонов; нуклеиновых кислот, включая гены, рекомбинантные нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды, siPHK, вирусные гены и гены из микроорганизмов; и антигенов.

14. Способ получения липосомы по любому из пп.1-13, включающий смешивание общепринятых липидов с подходящим количеством, по меньшей мере, одного искусственного амфифильного производного пиридиния, и получение липосомы в соответствии с общепринятыми способами.

15. Фармацевтическая композиция, содержащая липосому по п.12 или 13 и фармацевтически приемлемый носитель.

16. Применение липосомы по любому из пп.1-13 в качестве средства доставки для in vivo и in vitro введения интересующего вещества в клетку-мишень, которая не специализирована для удаления и/или переработки частиц на основе липидов, в частности, когда указанная клетка-мишень выбрана из группы, состоящей из эндотелиальных клеток, эпителиальных клеток, мышечных клеток, клеток мозга, нервных клеток, клеток кожи, волосковых клеток, недифференцированных клеток-предшественников и перицитов.

17. Применение липосомы по любому из пп.1-13 в качестве средства доставки лекарственного средства.

18. Применение липосомы по п.12 или 13 при лечении рака, хронического воспаления, атеросклероза, тканевой регенерации/заживления, диабета или метаболического заболевания, связанного с дисфункцией клеток.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2013 года RU2482837C2

ЛИПОСОМАЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ, НЕЙТРАЛЬНЫЙ ЛИПОПОЛИМЕР И СПОСОБ УВЕЛИЧЕНИЯ ВРЕМЕНИ ЦИРКУЛЯЦИИ ЛИПОСОМЫ 2000
  • Залипски Сэмюель
RU2250911C2
Способ обработки целлюлозных материалов, с целью тонкого измельчения или переведения в коллоидальный раствор 1923
  • Петров Г.С.
SU2005A1
EP 0755924 A1, 29.01.1997.

RU 2 482 837 C2

Авторы

Кампс Йоханнес Адрианус Антониус Мария

Молема Гритье

Рейтерс Марсель Херман Йозеф

Адриан Йоанна Эва

Даты

2013-05-27Публикация

2008-09-05Подача