Электрохимический датчик для определения концентрации веществ в растворах Советский патент 1983 года по МПК G01N27/30 

Изобретение относится к электрохимическим датчикам, которые применяют для селективного определения к центраций соединений (например, глю козы Ь растворенных в жидкостях (на пример, в крови. Известен селективный по отношени к молекулам электрохимический чувствительный датчик, который применяют для определения соединений, растворенных в жидкостях 13Известный датчик обладает малой механической прочностью. Наиболее близким техническим решением к предлагаемому является электрохимический датчик для определения концентрации веществ в раст ворах, содержащий Kopnyt:, заполненный . электричеством, в котором рас-.. положены индикаторные и сравнитель- ный электроды, соединенные с источНИКОМ питания и регистрирующим прибором, в сТенке которого расположен фильтр, а на торце гаэопр1оницаемая мембрана, на которой размещен гелевый слой, содержащий в химически связанной форме фермент. .Механизм действия известных селективных по отношению к молекулам чувствительных элементов гЮжет бытЁ описан следующим образом. MoлeкyJML определяемых компонентов (молекулы так Называемых субстратов, например молекулы глюкозы и в некоторых случаях молекулы реагента (молекулы кислорода; диффундируют в слой, который содержит селективный фермен например, глюкозооксидаэу) и который служит в качестве специфично ак тивного катализатора, т.е. в так на зываемый реакционный слой, где происходит химическая реакция. Сигнал, выхоДяший из индикаторого электрода, является однозначной функцией концентрации или активности реагента, принимающего участие в реакции ферментации, или участвующих или образующихся компонентов. Когда все факторы можно считать постойнными, локальное значение активности или концентрации зависит от скорости ре акции, которая является однозначной функцией концентрации субстрата. Поэтому в стационарном состоянии посредством измерения силы тока или значения ЭДС непосредственно может быть определена концентрация желаем го соединения в пробе Г 2 . Недостатком простых датчиков явл ется короткий срок их службы (напри мер, несколько дней, одна-две недели) , что может быть объяснено недостаточно приемлемыми свойствами реакционного слоя. Кроме того; принимая во внимание наличие гелевого слоя, в котором содержится связанны фермент, чувствительный элемент, за исключением времени использовани необходимо держать при пониженной температуре (например, от -1 до +2°С) для того, чтобы можно было сохранить его ферментативную активность. Известные датчики легко повреждаются, не обладают механической прочностью и имеют продолжительное время реагирования (например, от 2 до 8 мин ). Цель изобретения - повышение механической прочности и службы датчика. Поставленная цель достигается тем, что электрохимический датчик для определения концентрации веществ в растворах, содержащий корпус, заполненный электролитом, в котором расположен индикаторный и сравнительный электроды, соединенные с источником питания и регистрирующим прибором, в стенке которого расположен фильтр, а на торце газопроницаемая пленка, на которой размещен гелевый слой, содержащий в химически связанно форме фермент, а между корпусом чувствительного элемента и индикаторным электродом расположен изоляционный слой, дополнительно содержит мембрану, изготовленную из вещества природного про-, исхождения и содержащую в химически иммобилизованной форме в поверхностном слое ферменты одного или нескольких титюв, причем мембрана находится в контакте с газопроницаемой пленкой. Мембрана природного происхождения находится в контакте с защитной сеткой или тканью, выполненной из- ийертного материала. В корпусе расположено несколько индикаторных электродов. После иммобилизации активированные природные мембраны в сухом состоянии (в некоторых случаях при комнатной температуре) могут храниться очень продолжительное время ( от 0,5 до 1 года) без заметного, изменения активности фермента, так как фермент находится в естественном окружении. Проницаемость природных мембран по отношению к ионам, воде и молекулам газа является идеальной в отношении техники измерения. Другим благоприятным свойством природных мембран является то, что они являются проницаемыми по отношению к ионам и молекулам газа, которые применяются в качестве реагента или реакционного продукта, и непроницаемые по отношению к соединениям с более высоким молекулярным весом, которые могут оказывать влияние на результаты измерения (например, субстрат или другие содержащиеся в пробе вещества;, вследствие чего частично или полностью может быть устранен так называемый эффект гистерезиса, который часто наблюдается при замене проб с различными концен трациями. Предлагаемой датчик построен таким- образом, что при создании реак;ционного слоя применяют мембрану ic двумя реакционными слоями, или несколько наложенных друг н дру- га мембран с одним или двумя реакционными слоями. При таком расположении с поверхностью каждой мембраны связан другой ф змент в иммобилизованной форме. В случае f)-rnn хозидиого электрода поверхность мембраны содержит со стороны исследу емого раствора f -глюкозидазу, а со стороны индикаторного электрода гяюкозооксидазу. Связанный с первой мембраной фермент { -глюкоз и даза дает возможность осушествления реакоян гидролиза меявду определяемы ми компонента т, между р-глюкозиjQ OM (например, амигдалином или сализином) и водой, в результате чего, кроме прочего, образуется глю :Коза. Связанный со второй мембраной -Фермент-глюкозооксидаза катализиру ет реакцию между глюкозой и кислородом. На находящемся под мембраной индикаторном электроде может быть изменен сигнал, пропорциональный концентрации кислорода. Сигнал, пропорциональный уменьшению концентрации кислорода является однозначной функцией концентрации определяе мой про(Нл. При подобном осуществлении изобрётения, с одной стороны, может быть осуществлено упрощение в отношении техники измерения и достигиуто повьшение селективности, а, с другой стороны, могут быть определены такие соединения, которые в одностадийной реакции не образуют компонентов, количество которых может быть измерено, или которые не показывают изменений концентрацииили активности определяемых ком понентов. Чувствительный элемент также может быть построен таким образом, чт с разделенными участками поверхности мембраны природной структуры, которая служит реакционной зоной, или с определенными участками поверхности в статистически гомогенном распределении связаны ферменты различных сортов, и каждому из учас I ков поверхности соответствует один :или несколько индикаторных электрод При таком построении может Оытъ получен селективный по отношению к молекулам чувствительный элемент с несколькими функциями без увеличения размера, в результате чего .может быть осуществлено параллельно определение нескольких компонентов в одном и том же исследуемом растворе, или с параллел-ьным определением концентрации мешающих компонен тов, влияние которых может быть исключено вручную или автоматически. При другом варианте осуществления изобретения чувствительный элемент получают посредством того, что, например, в случае чувствительного элемента для промышленных целей, имеющего большие размеры, для дальнейшего повышения механической прочности реакционной зоны мембрану природной структуры вводитВ контакт с инертной полимерной сеткой или тканью. В других вариантах осуществления изобретения для достижения очень короткого времени реагирования на поверхностном слое одной из сторон мембраны природной структуры создают реакционную зону, которая содержит фермент в иммобилизованной форме а на поверхностном слое другой стороны мембраны природной струкруты в зависимости от способа пропитки создают с помощью процесса а1швки такой слоя,-который проницаем для газа или обладает ионнообменными свойствами. Селективный по отношению к молекулам .чувствительный элемент изготавливают таким образом, что поверхность мембраны природной структуры обрабатывают при комнатной температуре раствором, в котором содержится фермент и бифункциональный реагент, имеющий группы, подходящие для образования химических связей, например . глутаровый альдегид. После завершения реакции мембрану помешают-в водяную баню с дистиллированной водой, где производят вымывание компонентов, оставшихся в водорастворимой форме. После завершения операции промывки мембрана находится в готовом к измерениям состоянии. После этого в некоторых случаях изготавливают металлический индикаторный элек трод. с целью очистки поверхности индикаторного электрода его несколько минут держат в азотной кислоте, затем промывают и помещают в ванну, в которой содержится восстановитель (например, аскорбиновая кислота, где происходит превращение окисей и физически растворенного в металлическом электроде кислорода. Готовую мембрану совместно с оболочкой, проницаемой для газа или для газа и растворенных веществ, помещают на корпус чувствительного элемента, после чего индикаторный электрод и электрод сравнения погружают в находящийся в корпусе чувствительного элемента раствор электролита таким образом, что поверхность индикаторного электрода находится в непосредственной близости от мембраны. Электроды закрепляют. В результате получают -чувствительный элемент в готовом к измерениям состоянии.

На чертеже показан селективный в отношении глюкозы чувствительный элемент, частичный разрез.

Пример. В полости корпуса 1 чувствительного элемента находитс буферный раствор 2, содержащий хлорид-ионы, в который погружены укрепленный в камере 3 платиновый индикаторный электрод 4 и серебряный . ( галогенсеребряный ) электрод 5 сравнения.

Конец корпуса 1 чувствительного элемента закрыт проницаемой дня газа полипропиленовой пленкой б, которая находится в контакте с индикаторным электродом 4. Проницаема для газа пленка б находится в контакте с мембраной 7 природного происхождения, изготовленной из кишкц свиньи, причем глюкозооксидаза (Е.С.1.1.3.4. иммобилизирована с помощью глутарового альдегида. Проницаемая для газа пленка б и мембрана 7 природного происхождения прикреплены к корпусу 1 чувствительного элемента резиновым кольцом 8.

Другой конец корпуса 1 чувствительного элемента закрыт пластиковым колпачком 9. Индикаторный элетрод 4 и электрод 5 сравнения с помощью кабеля 10 соединены -с источником поляризующего напряжения и-с. входом в прибор для измерения силы тока.

Изготовление селективного по отношению к глюкозе- электрода осуществляют следующим способом.

Часть имеющейся в продаже засоленной кишки свиньи вымачивают 10-15 мин в дистиллированной воде. Разбухшую мембрану совместно с проницаемой для газа пленкой (например из полипропилена) толщиной 15 в растянутом состоянии закрепляют на конце корпуса чувствительного элемента ( полипропиленовая пленка должна находиться со стороны полости корпуса чувствительного элемента) Мембрану подсушивают в течение 20 мин. Затем в 0,5 мл буферного раствора с рН 7,4 суспендируют 60 мг глюкозооксидазы Е.С. 1.1. 3. 4.) и добавляют 25 мкл 25%-ного раствора глутарового альдегида.20 мкл полученной гомогенной суспензии равномерным .слоем наносят на поверхность мембраны. После этого мембрану сушат в течение 20 мин и затем посредством промывки дистиллированной водой производят удаление неиммобилиз-ованного фермента и избытка глутарового альдегида. Приготовленная указанным способом мембрана, содержащая фермент глюкозбоксидазу в И1ир лобилизованной форме, находится в готовом к измерениям или хранению состоянии.

После изготовления активированной мембраны, которая известным способом

закреплена на подложке, приготавливают платиновый индикаторный электрод. Поверхность индикаторного электрода в течение 2-3 мин выдерживают в нанесенном на ,стеклянную пластину растворе азотной кислоты с концентрацией б моль/дм. Затем азотную кислоту смывают дистиллированной водой. После промывки поверхность индикаторного электрода выдерживают

0 в свежеприготовленном 2%-ном растворе аскорбиновой кислоты в течение 20-30 мин. После указанной обработки аскорбиновую кислоту удаляют с поверхности индикаторного электрода посредством дистиллированной водой. После промывки индикаторный электрод находится в готовом к измерениям состоянии (процесс обработки азотной кислотой и аскор биновой кислотой необходимо повторять

при проведении измерений через каждые две-три недели),

После подготовительных операций собирают селективный по отношению 5 к глюкозе чувствительный элемент, который затем подключают к источнику поляризующего напряжения и к прибору для измерения силы тока.

Определение концентрации глюкозы 0 в пробе может быть осуществлено

чувствительным элементом посредством снятия калибровочной кривой или аддитивным методом. Ниже приводится предпочтительный вариант аддитивного метода, который известен как метод многократного добавления проб.

Установлено, что между уменьшением измеренной силы тока (ui) и концентрацией глюкозы в растворе (с) существует следующая зависимость:

л -к-Л

(Л

t

V К

где

максимальная скорость реакции;

константа Михаэлиса для реакции фермент-субстрат

R множитель пропорциональности.

Из значения измерения уменьшения силы тока в двух содержащих глюкозу растворах с известными концентрациями могут быть определены значения N и К для данных условий и данного чувствительного элемента, по которым может быть определена концентрация VI-го исследуемого раствора по уменьшению силы тока, в соответствии со следукадей формулой:

(И±к11.. .

Си--1.

2 Принимая во внимание уравнение 2 , концентрация пробы равняется

с-г u..

jq

(Ь)

OH

где aCh) объем -й пробы/ V - обший объем пробы и стандартного раствора.

В случае крови и мочи измерение методом многократного добавления проб осуществляют описанным ниже способом.

В термостатитрованную при 37 С ячейку отмеряют 6,6 мл буферного раствора со значением рН 7,4. В расвор погружают чувствительный элемент. Из значения силы тока, измеренного после добавления 50 мкл содержащих глюкозу растворов, которые имеют концентрацию 2-Ютмоль/дм расчетом или автоматически определяют значения V и К . После это1х в буферный раствор вводят известный объем пробы и определяют изменение силы тока. (В зависимости от о жид аемого содержания глюкозы в исследуемом образце крови выбирают соответствующий объем пробы. В случае проб с концентрациями между 60 и 200 мг-% объем проб должен составлять 100 мкл, в случае более разбавленных проб 200 мкл, а при более концентрированных пробах 50 мкл. В случае образцов мочи с концентрациями 0-1 г-% добавляют 50 мкл, при более концентрированных пробах производят разбавление в десять раз, а в случае разбавленных проб добавляют . 25-50 мкл). Из измеренного значения уменьшения силы тока рассчитывают определяемую концентрацию по уравнению (2) вручную или компьютером.

Измеренные селективным по отношению к глюкозе чувствительным элементом значения для некоторых проб приведены в табл. 1.

Таблица

1. ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЙ ДАТЧИК ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ВЕЩЕСТВ В РАСТВОРАХ, содержащий корпус, заполненный электролитом, в котором расположены индикаторный и сравнительный электроды, соединенные с источником питания и регистрируюшим прибором, в стенке которого расположен фильтр, а на торце газопроницаемая пленка, на которой размещен гелевый слой, содержащий в химически связанной форме фермент, а между корпусом чувствительного элемента и индикаторным электродом расположен изоляционный слой, отличающийся тем, что, с целью повышения механической прочности и срока службы, датчик дополнительно содержит мембрану, изготовленную из вещества природного происхождения и содержащую в химически иммобилизованной форме в поверхностном слое ферменты одного или несколькнх видов, причем мембрана находится в контакте с газопроницаемой пленкой. 2.Датчик по п. 1, отличающийся тем, что мембрана природного происхождения находится в контакте с защитной сеткой или тканью| выполненной Из инертного материала. 3.Датчик по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в корпусе . расположено несколько индикаторных электродов. 00 4 эо

Количество

параллельных

измерений

180

11 11 11

120

90 Из таблицн видно, что разброс значений, измеренных с помощью селективного по отношению к глюко чувствительного злемента, значите но меньше, чем разброс значений, полученных известными методами, п которых разброс часто превосходит 10%. В соответствии с данным примером также могут быть изготовлены Мочевая кислота Холестерин U-Аминокислоты Т) -Аминокислоты

Среднее значение измеренных величин, мг-%

180

121

91

Та б л и ц а 2 УреазаПлатина Е.С.1.7.3..3. Холестериноксидаза Платина E.G.1.1.3.6. Оксидаза U-аминокислот То же Е.С.1.4.3.2. Окисидаза D -аминокислот .С.1.4.3.3. гие чувствительные элементы; селективные по отношению к молекулам. В табл. 2 приведены виды молекул, по отношению к которым селективен чувствительный элемент, иммобилизированные на природной мембране ферменты, которые находятся в соединении с проницаемой для газа тонкой пленкой, и типы индикаторных электродов.

Б«С«1«о«3 1

Оксалатоксидаэа Ё.С.1.2.3.4.

ксантиноксйлаэа Е.С.1.2.3.2.

Ь- д фенолоксидйза ол Ё.С.1.10.3.1. Аналогично могут быть иэготов- 20 лены другие селективные по отяошёйию к молекулам чувствительнее элементы, при этом в .качестве меМИммобилизованный

Определяемый

фермейт компонент

ОксиДй , It -амийокисилаланинлоты .1.4.3.2. н

йксИйааа L-амииокислоты

S w%l«4r«i3«

Ойсидаза .i -аминоТЫкислоты E.G.1.4.3.2.

Ф-Сериндегидаатаза Ё.С.4.2.1.14.

гомосериндегидратаз а Е.С.4.2.1.15.

Треониидегидратаза Е.С.4.2.1.16.

Гистида§а Б.С.4.3.1.3.

НиТритредуктаза Е.С.1.6.6.4.

П р и м е р 2. Бифункциональный селективный по отношению к молекулам чувствительный элемент.

В корпусе 1 чувствительного элемента находится содержащий хлрридионы буферный раствор 2, в который

Продолжение табл 2

:цн

«.« -

1: а 6 л и ц а 3

HHAHitaTopHHft электрод

Электрод, селективный к ионам аммония

То же

п.

я

- -

« «

погружены два платиновых индикаторных электрода 4, встроенных по отдельности в камеры 3. С поверхностью индикаторных электродов 4 находится в контакте проницаемая для газа полипропиленовая пленка 6, укрепленбраны может быть использована стёнка рыбьего воздушного пузыря, кишки овцы и т, д. (см. табл. .3J, ная в отверстии корпуса 1 чувствительного элемента. Поверхность пленки 6 покрыта куском оболочки, а именно мембраной природного происхождения. С частью поверхности мембраны 7 природного происхождения, которая находится в контакте с одним индикаторным электродом или, соответственно, с таким же участком поверхности мембраны с противоположной стороны, связана ок сидаза D-аминокислоты в иммобилизированной форме, а с другим участком поверхности мембраны, который находится в контакте с другим индикаторным электродом или, соответственно, с таким же участком поверхности мембраны с противоположной стороны, связана оксидаза Ь -аминокислоты в иммобилизованной форме. Остальные детали строения бифунк ционального чувствительного элемента, селективного к мо/лекулам, аналогичны строению чувствительного элемента, описанного в примере 1. Получение реакционного слоя, ко торый содержит оксидазу аминокислоты, осуществляют следуквдим образом На проницаемой для газа полипро пиленовой пленке закрепляют влажную мембрану. Затем мембране в течение 30 мин дают возможность высох нуть при комнатной те 1пературе. По ле этого на часть поверхности мембраны наносят, равным слоем 10 мкл такого фосфатного буферного раство ра, рН значение которого составляет 8,3 ив котором в каждых 0,1 мл содержится 5 мг оксидазы L -амино кислоты в суспендированной форме (Е.С.1.4.З.З., сигма кристаллическая) , после чего производят добавление 10 мкл 25%-ного раствора глу тарового альдегида. Непосредственно после этого на другую часть пове ности мембраны наносят равномерным слоем 10 мкл такого фосфатного буферного раствора, который содержит

Глюкозооксидаза Е.С.1.1.3.4.

Глюкозооксидаза Е.С.1.1.3.4.

Уреаза

E.G.3.5.1.5.

Алкогольоксидаза Е.С.1,1.3.1.9.

Гексозооксидаза

Е.С.1.1,3.5.

Креатининаза

н Е.С.3.5.3.3,

Уреаза

Е.С.3.5.1.5. 10 мг оксидазь) j -аминокислоты (B.C.1.4.3,2., сигма (V ) в суспендированной форме, после чего производят прибавление 10 мкл 25%-НОГО раствора глутарового ашьдегида. Остальные стадии, изготовления чувствительного элемента аналогичны описанным в примере 1. С помощью бифункционального селективного по отношению к молекулам чувствительного элемента параллельно мозюет быть произведено селективное определение Ь и Л изомеров аминокислот. Измерение осуществляют с-ледукяцим образом. Селективный чувствительный элемент калибруют сначала раствором, содержащим Ь -форму, а затем раствором, содержащим 1 -форму, определяемой аминокислоты (например, фенилаланина). При осуществлении калибровки чувствительный элемент из перемешиваемого фосфатного буферного раствора ( рН 8) помещают в перемешиваемый с постоянной скоростью стандартный раствор с таким же значением рН и измеряют изкюнение интенсивности тока( U ) , возникгиощее при действии поляризующего напряжения - 0,6 В. Если значение ui представляет собой функцию концентрации стандартного раствора, то может быть построена калибровочная кривая, с помощью которой после измерения л может быть определено соотношение оптических изометров различных аминокислот. Применение изготовленного в со- . ответствии с данным примером комплексного чувствительного элемента чрезвычайно полезно при исследовании эффективности процесса резольвации. Для определения соотношения и.зомеров может быть применен аддитивный метод, описанный в примере 1. По аналогии могут быть изготовлены другие применяемые и соответствующие данному изобретению бифункциональные се-лективные по отношению к молекулам чувствительные элементы (.см,табл. 4. Таблица 4. .

Глюкозооксидаза

Глюкоза B.C.1.1.3.4. Примерз. Многофункциональ ный селективный по отношению к молекулам чувствительный элемент, ко торый может быть применен для пара лельного определения различных ами нокислот . Строение многофункционального чувствительного элемента подобно строению бифункционального чувствительного элемента, описанного в примере 2. Отличие закл1рчается в том, что этот чувствительный элемент не содержит проницаемую дл газа пленку б и что, кроме того, .в раствор 2 электролита, находящегося в корпусе 1 чувствительного элемента, погружены три селективны к ионам водорода стеклянных электрода 4, которые находятся в контакте с мембраной 7 природного про хождения, на которой три хорошо отделенных участка поверхности обра- зуют три различных реакционныз слоя, которые содержат три селективные декарбоксилазы аминокислот ( декарбоксилазу L-лизина, декарбо силазу L -тирозина, декарбоксилазу L-фенилаланина) в иммобилизованной форме.

Продолжение табл. 4

Глюкозидаэа E.G.3.2.1.1.21.

Глюкозооксидаза Е.С.1.1.3.4 Изготовление реакционных слоев осуществляют по аналогии с описанным в примере 2. С помощью селективного по отношению к молекулам чувствительного элемента селективно может быть определено содержание Ь -тирозина, LI -лизина и L -фенилаланина в прюбах, содержащих аминокислоты. Определение может быть осуществлено с помощью трех соответствующих трем аминокислотам калибровочных кривых, показывающих зависимость концентрации от потенциала. Также могут быть изготовлены аналогичные варианты многофункционального чувствительного элемента, селективного по отношенню к молекулам. Отдельные реакционные слои содержат в иммобилизованном состоянии следующие ферменты: декарбоксилазу L, -аргинина, декарбоксилазу li -глутаминовой кислоты, декарбоксилазу U -глутамина, декарбоксилазу L -гистидина, уреазу. Предлагаемое устройство позволяет получать электроды с высокой механической прочностью и продолжительным сроком службы.