Способ культивирования каллусной ткани жень-шеня- продуцента биологически активных веществ Советский патент 1987 года по МПК C12N5/00 

оо о

сд

со

Изобретение относится к микробиологической промьшленности и касается технологии получения и вьфащивания пересадочньк культур растительных тканей, используемых в качестве продуцентов биологически активных веществ в различных отраслях промышленности.

Известен способ культивирования каллусной ткани жень-шеня - продуцента биологически активных веществ путем выращивания посевного материала на питательной среде с кинетином с последующим пересевом на питательную среду и отбором выросшей биомассы для выделения биологически активных веществ.

Однако известный способ не обеспечивает высокого выхода биологически активных веществ. Целью изобретения является повьше- 20 ние выхода биологически активных веществ. Цель достигается тем, что в способе культивирования каллусной ткани жень-шеня - продуцента биологически активных Веществ путем выращивания посевного материала на питательной среде с кинетином с последующим пересевом на питательную среду и отбором выросшей биомассы для выделения био- 30 логически активных веществ отличител ной особенностью является то, что по севной материал пересевают на питательную среду, содержащую (мг/л воды сахарозу 25000-35000, тиамин-хлорид 0,3-0,6, мезоинозит 70-90, С-нафтилуксусную кислоту 1,5-2,5, никотинову кислоту 1,5-2,5, агар-агар 5500-6500 хелат 4,5-5,5, макроэлементы по Мурасиге и Скугу 4,5-4,57 -10, микроэлементы по Мурасиге и Скугу 38 38,22, отбирают часть выросшей биомассы, а оставшуюся часть биомассы используют на стадии вьфащивания посевного материала. Способ осуществляют следующим образом. Приготавливают питательную среду. Затем разливают питательную среду в емкости для культивирования. Стерилизуют емкости с питательной средой. После этого культивируют каллус ную ткань, пересаживают часть выращенной ткани (1/10 от общего объема) на свежую питательную среду того же состава. Затем пересаживают выращенную ткань (9/10 от урожая) на модифицированную питательную среду.

Модифицированная питательная среда содержит микроэлементы по Мурасиге и Скугу, микроэлементы по Мурасиге и Скугу, сахарозу, тиамин-хлорид, мезоинозит, гидролизат казеина, 2нафтилуксусную кислоту, никотиновую кислоту, агар-агар, железо-хелат.

Культивируют пересаженную ткань на модифицированной питательной среде, при этом предусматривается возможность многократного выращивания на модифицированной среде до тех пор, пока биологическая активность биомассы не станет минимальной. После этого биомассу пересаживают на полную питательную среду Мурасиге и Скугу и используют в дальнейшем как инокулюм.

Затем отбирают и высушивают каллусную ткань, растущую на модифицированной среде, экстрагируют и получают биологически активные вещества из каллусной ткани, культивируемой на модифицированной среде. Пример 1 (контроль), Процесс получения биологически активных веществ включает ряд операций. Приготавливают питательную среду. Используют среду Мурасиге и Скугу следующего состава: Макроэлементы по Мурасиге и Скугу Микроэлементы по Мурасиге и Скугу Сахароза30000 мг/л Тиамин-хлорид 0,4 мг/л Мезоинозит 80 мг/л Гидролизат казеина 500 мг/л Кинетин1 мг/л -Нафтилуксусная 2 мг/л кислота 6000 мг/л Агар-агар 5 мг/л Fe-хелат В тщательно вымытые культивационные флаконы разливают по 250 мл питательной среды. Флаконы со средой укупоривают и автоклавируют для уничтожения микроорганизмов , Бокс стерилизуют бактерицидными лампами, инструменты в суховоздушном шкафу при 150-200 с завертывают в бумагу Крафт, Затем стерильными инструментами материал извлекают из флакона и пересаживают в подготовленные флаконы со средой по 1 г. Флаконы укупоривают и переносят в культивационную комнату, где стабильно поддерживается температура и влажность 70%, откультивированисутствует свет. 30 сут. Снимают урожай для получения био логически активных веществ. 1/10 час выращенной биомассы используют в ка честве инокулюма, пересаживая на св жую питательную среду того же соста ва. 9/10 высушивают и экстрагируют биологически активные вещества этил вым спиртом при соотношении сырье: экстрагент 1:10, Определяют прирост биомассы биол гически активных веществ и продукти ности. Для контроля за ростом культ ры и выходом биологически активных веществ проводят определение сухого веса (не менее пяти повторностей), суммы гликозидов (биологически.актив ных веществ) весовым методом и продуктивности. Сухой вес биомассы 10,44 г/л Сумма гликозидов 4,2%, Продуктивность биомассы 438,5 мг/ Пример 2. Получение биологически активных веществ из каллусной ткани, растущей на модифицирован ной среде Мурасиге и Скуга содержащей:Макросоли по Мурасиге и Скугу Микроэлементы по Мурасиге и Скугу 25000 мг/л Сахарозу 0,3 мг/л Тиамин-хлорид 70 мг/л Мезоинозит 450 мг/л Гидролизат казеина t-Нафтилуксусную 1,5 мг/л кислоту Никотиновую кислоту 1,5 мг/л Агар-агар5500 мг/л Fe-хелат4,5 мг/л Операции культивирования и полу- чения биологически активных веществ описаны в примере 1, На данной среде выход биомассы по сухому весу 10,3 г/л, биологическ активных веществ (суммы гликозидов) 4,15%, продуктивность 427,5 мг/л. Пример 3, Получение биологи чески активных веществ из каллусной ткани, растущей на.модифицированной среде Мурасиге и Скуга следующего состава: Макросоли по Мурасиге и Скугу Микроэлементы по Мурасиге и Скугу Сахароза30000 мг/л Тиамин-хлорид 0,4 мг/л Мезоинозит80 мг/л Гидролизат казеина 500 мг/л 1 3 Р-Нафтилуксусная кислота2 мг/л Никотиновая кислота 2 мг/л Агар-агар6000 мг/л Fe-Хелат5 мг/л Операции по культивированию и получению биологически активных веществ описаны в примере 1. Выход сухой биомассы жень-шеня составляет 11,8 г/л, биологически активных веществ - 4,18%, продуктивность - 493,3 мг/л. Среда обеспечивает наиболее высокий выход биомассы и соответственно наибольший выход биологически активных веществ. Пример 4. Получение биологически активных веществ из каллусной ткани, растущей на питательной среде следующего состава: Макросоли по Мурасиге и Скугу Сахароза35000 мг/л Тиамин-хлорид 0,6 мг/л Мезоинозит 90 мг/л Гидролизат казеина 550 мг/л Е-Нафтилуксусная кислота2,5 мг/л Никотиновая кислота 2,5 мг/л Агар-агар 6500 мг/л Fe-хелат5,5 мг/л Описание операций по культивированию и получению биологически активных веществ приведено в примере 1. На этой среде выход биомассы по сухому весу 11,65 г/л, суммы гликозидов - 4,05%, продуктивность 471,8 мг/л. Пример 5. Культивирование каллусной ткани и получение из нее биологически активных веществ при многократном использовании модифицированной питательной среды, указанной в примере 3. Подробные операции по культивироваию и получению биологически активных еществ описаны в примере 1. При одноратном культивировании (1 пассаж) ыход сухой биомассы 11,80 г/л, сумы глигозидов - 4,18%, продуктивость - 493,3 мг/л. При двукратном культивировании II пассажа) ВЕЛХОД сухой биомассы 3,15 г/л, суммы гликозидов -3,25%, родуктивность - 427,4 мг/л. При трехкратном культивировании III пассажа) выход сухой биомассы 3,97 г/л, суммы гликозидов - 2,9%, родуктивность - 405,1 мг/л.

510360536

При четьфехкратномкультивирова-12,53 г/л, суммы гликозидов - 2,5%

НИИ (IV пассажа) выход сухой биомас-продуктивность 313,2 мг/л. сы 13,56 г/л, сумма гликозидов -Предложенный способ позволяет уве2,5%, продуктивность - 339,0 мг/л,личить выход биологически активных

При пятикратном культивированииным, а также сократить расход кинетиг

{V пассажей) выход сухой биомассына в 10 раз.

5веществ на 35% по сравнению с извест

СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ ЖЕНЬ-ШЕНЯ - ПРОДУЦЕНТА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ путеы выращивания посевного материала на питательной среде с кинетином с последующим пересевом на питательную среду и отбором выросшей биомассы для вьщеления биологически активных веществ, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода биологически активных веществ, посевной материал пересевают на питательную среду, содержащую (мг/л воды) сахарозу 25000-35000, тиамин-хлорид 0,3 0,6, мезоинозит 70-90, f-нафтилуксусную кислоту 1,5-2,5, никотиновую кислоту 1,5-2,5, агар-агар 5500-6500, хелат 4,5-5,5, макроэлементы по Мурасиге и Скуту 4,5-4,57-10, микроэлементы по Мурасиге и Скугу 38-38,22, отбирают часть вьфосшей биомассы, а оставшуюся часть биомассы исполь(Л зуют на стадии выращивания посевного материала.