Способ культивирования каллусной культуры полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) Российский патент 2020 года по МПК C12N5/04 

Изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть использовано для пищевой и фармацевтической промышленности как источник сырья для пищевой добавки и биологически активных веществ.

Полынь обыкновенная, чернобыльник, Artemisia vulgaris L., относится к семейству сложноцветных. Строение корневища крепкое, немного ветвистое. Стебли прямостоячие, красно-бурые, наверху разветвленные, до 1,0-1,5 м высотой. Листья сверху голые или слегка пушистые, темно-зеленые, снизу сероватые, паутинисто-войлочные, перисто-рассеченные на удлиненные зубчатые доли. Цветки очень мелкие, собраны в яйцевидные корзинки 2-4 мм шириной, составляющие широкое, несколько поникающее, метельчатое соцветие; обертка каждой корзинки покрыта густым войлочком; цветки красноватые, реже желтые. Цветет в июле-августе. Места произрастания пустыри, огороды, сорные места, возле жилья, реже луга и берега рек.

Используемые органы полыни обыкновенной: верхушки цветущих растений. Для заготовки сырья собирают лиственные цветоносные верхушки в период цветения. Установлено, что в траве содержится эфирное масло (до 0,61%), аскорбиновая кислота (175 мг %), каротин, немного дубильных веществ. В состав эфирного масла входят туйон, цинеол, борнеол. Известно, что в условиях произрастания в Якутии листья полыни обыкновенной содержат на сырой вес до 130 мг% аскорбиновой кислоты и 11 мг% каротина, при этом в траве содержится 0,04-0,05% эфирного масла (см. Макаров А.А. Лекарственные растения Якутии и перспективы их освоения. - Новосибирск: Издательство СО РАН, 2002. - 264 с.). Масло характеризуется как жидкое, светло-желтое, со слабым запахом. Анализы образцов различного сбора на алкалоиды дали противоречивые показатели.

Растение широко применяется в народной медицине многих стран при различных заболеваниях женской половой сферы (аменорея, дисменорея), как обезболивающее и ускоряющее роды средство, а также в качестве успокаивающего, противосудорожного средства при эпилепсии, неврастении и других нервных заболеваниях. Помимо этого, отвар всего растения применяют при гастритах, как мочегонное; порошком из сухих веток засыпают раны. В китайской медицине листья применяют в качестве кровоостанавливающего, жаропонижающего, общеукрепляющего, а также антитоксического средства. Назначают при токсикозах, пиодермии, невралгиях. При бронхиальной астме назначают вдыхание дыма, получаемого от сжигания сухих стеблей и листьев. Наружно применяют ванны из отвара надземных частей растения при почечнокаменной болезни, при кожных заболеваниях. В якутской народной медицине отвар рекомендуют пить при головной боли, боли под лопаткой, при глистах, параличах и проказе. Известно, что трава входит в состав микстуры М.Н. Здренко (см. SU №115587, кл. А61К 35/78, опубл. 1958). Кроме того, растение употребляется в пищу: в дореволюционное время служило в иные периоды основным источником поддержания жизни.

Известны способы культивирования Artemisia annua L., например, по патенту CN №102487823 (кл. G01D 3/043, опубл 23.07.2008) молодые стебли растения дезинфицируют и поперечно режут на сегменты и культивируют в среде для укоренения. Далее пересаживают для укоренения в почву.

Ближайшим аналогом заявленного решения является разработка состава питательной среды для культивирования каллусной ткани Artemisia annua L. для ускорения роста каллусной ткани и высокого выхода биомассы (см. RU №2393217, кл. С12N 5/04, опубл. 27.06.2010), при этом, питательная среда содержит агаризованную среду с макро- и микросолями по Мурасиге и Скугу, фитогормоны, витамины, сахарозу, а в качестве гормона - бензиламинопурин (6-БАП).

При этом используется гормональный состав питательной среды, содержащий в качестве гормона роста только фитогормон 6-бензиламинопурин, что недостаточно для ускорения роста каллусной ткани и высокого выхода биомассы.

Задачей настоящего изобретения является получение каллусной культуры полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) для использования в качестве источника биомассы для пищевой добавки и для получения биологически активных веществ.

Для решения поставленной задачи способ получения каллусной культуры полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) включает стерилизацию семян интактных растений полыни раствором перекиси водорода (3 % раствор) в течение 10 мин и этилового спирта (70 % раствор) в течение 1 мин, ополаскивание, трехкратное отмывание в течение 5 мин в стерильной дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов, следующего состава, мг: NH₄NO₃ – 33000, KNO₃ – 38000, CaCl₂x2H₂O – 8800, MgSO₄x7H₂O – 7400, KH₂PO₄ – 3400, KI – 166, H₃BO₃ – 1240, MnSO₄x4H₂O – 4460, ZnSO₄x7H₂O – 1720, Na₂MoO₄x2H₂O – 50, CuSO₄x5H₂O – 5, CoCl₂x6H₂O – 5, FeSO₄x7H₂O – 5560, Na-ЭДТА – 7460, мезоинозит – 100, тиамин – 100, пиридоксин – 100, никотиновая кислота – 100, сахароза – 2500, вода – 1000 мл, агар – 7000, дальнейшее помещение листовых эксплантов растений, полученных в лабораторных условиях, в питательную среду следующего состава, мг: NH₄NO₃ – 33000, KNO₃ – 38000, CaCl₂x2H₂O – 8800, MgSO₄x7H₂O – 7400, KH₂PO₄ – 3400, KI – 166, H₃BO₃ – 1240, MnSO₄x4H₂O – 4460, ZnSO₄x7H₂O – 1720, Na₂MoO₄x2H₂O – 50, CuSO₄x5H₂O – 5, CoCl₂x6H₂O – 5, FeSO₄x7H₂O – 5560, Na-ЭДТА – 7460, мезоинозит – 100, гидролизат казеина – 500, тиамин – 100, пиридоксин – 100, никотиновая кислота – 100, сахароза – 30000, 2,4 дихлорфеноксиуксусная кислота – 1, цитокинин (6-бензиламинопурин) – 1, нафтилуксусная кислота – 1, вода - 1000 мл, агар – 12000, при этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 3 недели, при пересеве используют ¼ живых каллусных биомасс, полученные каллусные культуры сохраняют пересадкой каждые 21 суток.

Анализ признаков заявленного решения свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».

Совокупность существенных признаков обеспечивает решение заявленной технической задачи, а именно, получение каллусной культуры полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.).

Предлагаемое решение состоит в том, что за основу взяты стерильные свежие проростки, культивируемые в контролируемых условиях климатической камеры из семян интактного растения, фитомасса которого собрана на территории Амгинского района (с. Болугур) Республики Саха (Якутия) в фенофазах «конец цветения, начало плодоношения».

При этом семена стерилизовали раствором 3% перекиси водорода в течение 10 минут, затем 70% спиртовым раствором в течение 1 мин. После стерилизации материал трехкратно ополаскивали стерильной дистиллированной водой. Стерильные семена помещали на твердую питательную среду без гормонов. Культивирование проростков проводили до третьего-пятого настоящих листьев в течение трех недель.

Питательная среда Мурасиге-Скуга для культивирования свежих проростков растения содержит компоненты в количественном соотношении, представленном в таблице 1.

Из полученного проростка получают листовые экспланты, которые помещали в питательную среду с дополнительным добавлением гидролизата казеина, 6-бензиламинопурина, нафтилуксусной кислоты. Наиболее интенсивное каллусообразование получили при концентрации фитогормонов 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в 1 мг/л, 6-бензиламинопурина - 1 мг/л, α-нафтилуксусной кислоты - 1 мг/л. После образования каллусной ткани проводили его отделение и рассадку в культуральные сосуды (чашки Петри, конические колбы на 100 и 250 мл) со свежей питательной средой, того же состава.

Питательная среда Мурасиге-Скуга для получения каллусной ткани содержит компоненты в количественном соотношении, представленном в таблице 2.

Культивирование проводят в темноте, при 26±1°С, влажности помещения 70±5%, в чашках Петри с диаметром 90 мм. Цикл субкультивирования составляет 3 недели. При пересеве используют ¼ живой каллусной культуры. Полученные каллусные культуры пересаживали каждые 21 день, таким образом, сохраняя полученную ткань. В процессе культивирования определяют морфологические, цитологические характеристики, также отбирали для молекулярных исследований и химических анализов.

Технический результат - получение каллусной культуры полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.).

Полученный каллус характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки: каллусные культуры плотные, оформленные, имеют светло-серую окраску. Для определения веса сырой биомассы каллусные культуры отделяют от среды культивирования на бумажные фильтры и взвешивают. При анализе представленных кривых роста следует отметить замедление роста на 18-ые сутки культивирования, что позволяет использовать 3 недельный цикл выращивания. Ростовые параметры рассчитывали по сырому весу биомассы. Результаты представлены в таблице 3 и свидетельствуют о наличии стабильных ростовых характеристик.

Таким образом, выявлен способ получения каллусных культур полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) из листовых эксплантов проростков, полученных в лабораторных условиях. Таблица 1

Состав питательной среды Мурасиге-Скуга для культивирования проростков к получению стерильных эксплантов, мг/л

Компоненты: Содержание NH₄NO₃ 33000 KNO₃ 38000 CaCl₂x2H₂O 8800 MgSO₄x7H₂O 7400 KH₂PO₄ 3400 KI 166 H₃BO₃ 1240 MnSO₄x4H₂O 4460 ZnSO₄x7H₂O 1720 Na₂MoO₄x2H₂O 50 CuSO₄x5H₂O 5 CoCl₂x6H₂O 5 FeSO₄x7H₂O 5560 Na-ЭДТА 7460 Мезоинозит 100 Тиамин 100 Пиридоксин 100 Никотиновая кислота 100 Сахароза 2500 Вода 1000 Агар 7000

Таблица 2

Состав питательной среды Мурасиге-Скуга для получения каллусной культуры, мг/л

Компоненты: Содержание NH₄NO₃ 33000 KNO₃ 38000 CaCl₂x2H₂O 8800 MgSO₄x7H₂O 7400 KH₂PO₄ 3400 KI 166 H₃BO₃ 1240 MnSO₄x4H₂O 4460 ZnSO₄x7H₂O 1720 Na₂MoO₄x2H₂O 50 CuSO₄x5H₂O 5 CoCl₂x6H₂O 5 FeSO₄x7H₂O 5560 Na-ЭДТА 7460 Мезоинозит 100 Гидролизат казеина 500 Тиамин 100 Пиридоксин 100 Никотиновая кислота 100 Сахароза 30000 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота 1 6- бензиламинопурин 1 Нафтилуксусная кислота 1 Вода 1000 мл Агар 12000

Таблица 3

Ростовые параметры каллусных культур полыни обыкновенной

Показатели Значения, в г Индексы роста по весу сырой биомассы 0,1678 Удельный рост по весу сырой биомассы, сут -1 0,0084

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения каллусной культуры дикорастущего растения полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян полыни растворами перекиси водорода (3% раствор) в течение 10 минут, этилового спирта (70% раствор) в течение 1 минуты, трехкратное ополаскивание в стерильной дистиллированной воде в течение 5 минут, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов, следующего состава, мг: NH₄NO₃ – 33000, KNO₃ – 38000, CaCl₂x2H₂O – 8800, MgSO₄x7H₂O – 7400, KH₂PO₄ – 3400, KI – 166, H₃BO₃ – 1240, MnSO₄x4H₂O – 4460, ZnSO₄x7H₂O – 1720, Na₂MoO₄x2H₂O – 50, CuSO₄x5H₂O – 5, CoCl₂x6H₂O – 5, FeSO₄x7H₂O – 5560, Na-ЭДТА – 7460, мезоинозит – 100, тиамин – 100, пиридоксин – 100, никотиновая кислота – 100, сахароза – 2500, вода – 1000 мл, агар – 7000, дальнейшее помещение листовых эксплантов, полученных из проростков, в питательную среду следующего состава, мг: NH₄NO₃ – 33000, KNO₃ – 38000, CaCl₂x2H₂O – 8800, MgSO₄x7H₂O – 7400, KH₂PO₄ – 3400, KI – 166, H₃BO₃ – 1240, MnSO₄x4H₂O – 4460, ZnSO₄x7H₂O – 1720, Na₂MoO₄x2H₂O – 50, CuSO₄x5H₂O – 5, CoCl₂x6H₂O – 5, FeSO₄x7H₂O – 5560, Na-ЭДТА – 7460, мезоинозит – 100, гидролизат казеина – 500, тиамин – 100, пиридоксин – 100, никотиновая кислота – 100, сахароза – 30000, 2,4 дихлорфеноксиуксусная кислота – 1, 6-бензиламинопурин - 1, нафтилуксусная кислота – 1, вода - 1000 мл, агар – 12000; при этом культивирование растений проводят в темноте при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 3 недели. Изобретение позволяет получить каллусную культуру полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) в условиях in vitro. 3 табл.

Способ получения каллусной культуры полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.), включающий стерилизацию семян интактных растений полыни растворами перекиси водорода в течение 10 мин и этилового спирта в течение 1 мин, ополаскивание, отмывание в течение 5 мин в стерильной дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов, следующего состава:

NH₄NO₃ 33000 мг KNO₃ 38000 мг CaCl₂x2H₂O 8800 мг MgSO₄x7H₂O 7400 мг KH₂PO₄ 3400 мг KI 166 мг H₃BO₃ 1240 мг MnSO₄x4H₂O 4460 мг ZnSO₄x7H₂O 1720 мг Na₂MoO₄x2H₂O 50 мг CuSO₄x5H₂O 5 мг CoCl₂x6H₂O 5 мг FeSO₄x7H₂O 5560 мг Na-ЭДТА 7460 мг Мезоинозит 100 мг Тиамин 100 мг Пиридоксин 100 мг Никотиновая кислота 100 мг Сахароза 2500 мг Вода 1000 мл Агар 7000 мг

дальнейшее помещение эксплантов растений, полученных в лабораторных условиях, в питательную среду следующего состава:

NH₄NO₃ 33000 мг KNO₃ 38000 мг CaCl₂x2H₂O 8800 мг MgSO₄x7H₂O 7400 мг KH₂PO₄ 3400 мг KI 166 мг H₃BO₃ 1240 мг MnSO₄x4H₂O 4460 мг ZnSO₄x7H₂O 1720 мг Na₂MoO₄x2H₂O 50 мг CuSO₄x5H₂O 5 мг CoCl₂x6H₂O 5 мг FeSO₄x7H₂O 5560 мг Na-ЭДТА 7460 мг Мезоинозит 100 мг Гидролизат казеина 500 мг Тиамин 100 мг Пиридоксин 100 мг Никотиновая кислота 100 мг Сахароза 30000 мг 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота 1 мг 6-бензиламинопурин 1 мг Нафтилуксусная кислота 1 мг Вода 1000 мл Агар 12000 мг

при этом культивирование растений проводят в темноте при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 3 недели, при пересеве используют ¼ живых каллусных биомасс, полученные каллусные культуры сохраняют пересадкой каждые 21 сутки.