Способ получения биологически активных веществ Советский патент 1981 года по МПК C12N9/00 

1

t

Изобретение относится к технологии получениями выращивания переса- дочных культур растительных тканей, например культуры.ткани родиолы pdзовой, используемых в качестве продуцен1гов биологически активных веществ в различных отраслях промышленности,

Известны способы получения биологически активных веществ из культуры растительных тканей, заключающиеся в обработке культуры растительной ткани химическими мутагенами с целью интенсификации процесса (обработки К-йцт рдометилмочевиной в концентра-ции°0., 25-0,30 мМ) 11 и 2 .

. , ,.Йзвестён также способ получения алЛалоидйв из культуры ткани Rauwol:f,, заключающийся в том, что стери:дьн°о йррращивают семена до образования в-пробирка-х проростков, на дисках из стеблевой части проростков индуцируют каллусообразование, а затем каллус отделяют от первичного эксплантанта и пересаживают на измененную питательную среду, где он растет без признаков дифференцировки (неорганизованнь1й рост) .

Алкалоиды выделяют по общепринятой для корней Методике 3.

Недостатком известных способов является невысокий выход биомассы при двсщцати шестидневном ку.пьтивировании.

С целью получения родиолозидсодержащих веществ из культуры изолированной ткани была введена в культуру родиола розовая.

Цель изобретения,- повышение вы10хода биомассы и целевого продукта при сокращении срока культивирования. . ,

Указанная цель достигается тем, 15 что предварительно перед посадкой выросшую каллусную ткань родиолы розовой пересаживают на изменен.ную питательную среду и растят на ней 25- 28 сут до заложения меристемы корневых апексов.

Получение культуры ткани родиолы розовой осуществляют следующим образом,

Семена стерилизуют 0,1%-ным раствором сулемы.

Промывают в трех порциях стерильной дистиллированной воды.

Высаживают в среду Мурасиге и Скуга следующего состава:.макроэлементы по Мурасиге и Скугу; микроэлвменты по Мурасиге и Скугу; сахароза 2%; агар-агар 0,6%. Стерилизацию среды проводят в ав токлаве 0,8 атм 15 мин . Семена проращивают в течение 11,5 мес на свету под люминесцентными лампами в термостатированных сте рильных условиях до появления проростков 6-10 см высотой и диаметром стебля 1,2-1,5 мм в нижнем междоузлии. В качестве первичного эксплантан используют нижнее междоузлие. С соблюдением строгих правил асептики нижнее междоузлие разрезают на диск толщиной 1,5-2,0 мм. Диски помещают на питательную среду 2 следующего состава, мг/л: Макроэлементы по Мурасиге и Скугу Микроэлементы по Мурасиге и Скугу Сахароза,%2 Рибофлавин1 Тиамин-хлорид2 2,4-Д0,2 Аденин0,2 Пиридоксин 1 Fe-хелат. 5 Са-пентатенат1 Агар-агар,%0,6 На 60 день образовавшийся каллус отделяют от первичного эксплантанта и пересаживают на питательную среду того же состаёа. На ней каллус растят в течение 5-7 пассажей для его стабилизации. Продолжительность одного пассажа 40-45 дней. К концу пя того пассажа каллус переходит к неорганизованному росту, признаки мор фогенеза исчезают.Каллус становится более светлым, количество темно-бурых участков заметно уменьшается, и чезает серебристо-белый налет. Калл плотный, агрегированный. Выход биомассы составляет 150170 г/л по сырому весу. Количество родиолозида на абсолютно сухой вес (АСВ)0,07-0,08%. Для интенсификации процессов рос та и выхода биомассы, а также выход целевого продукта при одновременном сокращении сроков выращивания, пред гается изменение компонентов питательной среды, обеспечивающее редиф ференцировку, ограничивая ее образо ванием меристемы корневых апексов. Состав питательной среды, мг/п: Макроэлементы по Мурасиге и Скугу Микроэлементы по Мурасиге и Скугу Сахароза,%3 Тиамин-хлорид1 Мезоинозит100 ДНУ1 АденинОД Кинетин0,1 fe-хелат5 На указанной выше среде каллусная ткань плотная, слабо оводненная,серовато-желтого цвета. Отдельные участки серовато-коричневые, каллус матовый. Микроскопический анализ 20-24-дневного каллуса обнаруживает закладку меристемы корневого апекса.Цикл выращивания каллусной ткани составляет 25-28 суток. Выход биомассы за этот срок культивирования 380-400 г/л по сырому весуи 14-15 г/л по сухому весу. Количество родиолозида на АСЕ 0,3%. Из сухой биомассы готовят экстракт на 40° этиловом спирте. Соотношение сырье: экстрагент составляет 1:10. Экстракцию проводят в делительной воронке в течение одних суток. Экстрактивные вещества, содержащие родиолозид, получают выпариванием настойки в вакууме при . Количество родиолозидсодержащих веществ в абсолютной сухой биомассе составляет 25%. Пример 1. Каллусную ткань родиолы розовЬй получают и выращивают на питательной среде Мурасиге и Скуга следующего состава, мг/л: Макроэлементы по Мурасиге и Скугу Микроэлементы по Мурасиге и Скугу Сахароза,%2 Рибофлавин1 Тиамин-хлорид1 2,4-Д0,2 АденинО,2 Пиридоксин 1 ре-хелат5 Са-пентатенат1 Агар-агар,%0,6 На этой среде ткань растет 40-45 дн. без признаков морфогенеза. Выход биомассы составляет 150-170 кг/л по сырому весу. Количество родиолозида на АСВ 0,07-0,08%. Данная среда не обеспечивает достаточного выхода биомассы и целевого продукта. Пример 2. Для обеспечения выхода целевого.продукта использовали среду, .вызывающую редифференцировку, доведя ее до заложения меристемы корневых апексов. Использовали среду Мурасиге и Скуга со следующими добавками 3%;2,5-3,5; 25-35 г Сахароза Тиамин1 мг/л; 0,5-1,2 хлорид 100 МГ/Л) 80-120 Мезоинозит 1 мг/л, 0,8-1,1 АНУ 0,1 мг/л 0,08-0,13 Адеыин 0,1 мг/л; 0,1-1,0 .Кинетин 5 мг/л; 4,5-5,5, ре-хелат Данная среда к 20-24 дню культивирования вызывает редифференцировку (заложение меристе ш корневых апексов) . К 25-28- сут. выход бисмассы - 380-400 г/л, количество родиолозида 0,3% на АСВ.

Для увеличения выхода биомассы и целевого продукта необходимо изме-. нить питательную среду, обеспечивающую закладку меристемы корневых апексов.

Пример 3. Каплусную ткань родиолы розовой пересаживали на питательную среду Мурасиге и Скуга со следующими добавками, мг/л; Сахароза,%3

Тиамин-хлорид1

Мезоинозит100

АНУ, 1

Аденин0,1

Кинетин0,1

Fe-хелат5

На указанной среде ткань культивируют менее 25 сут (до 23-х сут). За этот период ткань достигает фазы линейного роста, выхода на плато по росту и накоплению биомассы не набЛЮДсШОСЬ.

Культивирование ткани менее 25 с нерентабельно.

Пример 4. Каллуснуш ткань культивируют на среде, указанной в примере 2,

Время культивации более 28 сут 30-35 дн).

За этот период ткань достигает г/л, но при этом ткань оводняётся, темнеет и появляется знчительное количество некротических участков.

Культивирование более 28 сут нецелесообразно.

Пример 5. Каллусную ткань культивируют на среде, указанной в примере 2.

Время культивирования 25-28 сут За этот период ткань по росту и накоплению биомассы выходит за плато

Сырой вес составляет 380-400 г/л, сухой вес - 13-14 г/л. Количество родиолозида составляет 0,3% на АСВ.

Наиболее оптимальным сроком культивирования являются 25-28 сут.

Формула изобретения

Способ получения биологически активных веществ, включающмй получение

0 каллусной ткани на твердой питательной среде и экстракцию растворителем, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода биомассы и целевого продукта, предваритель5но перед посадкой каллусную ткань пересаживают на питательную среду Мурасиге и Скуга, которая дополнительно содержит, г/л:

Сахароза 25-35

0 Тиаминхлорид 0,0005-0,0012 Мезоинозит 0,8-1,2 альфа-Нафтилуксусная

кислота 0,0008-0,0011

5 Аденин 0,00008-0,000013 Кинетин 0,00001-0,0001 Fe-хелат 0,0045-0,0055. и культивируют в течение 25-28 сут до заложения меристемы корневых

0 апексов.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Ковалева Т.А. Культура ткани . раувольфии змеиной. Автореф. канд.

5 дисс. М., 1973.

2.Саркисова М.А. Культура ткани дискореи дельтавидной как продуценту стероидных солонинов. Автореф.канд.. дисс. М., 1973.

0

3.Патент Японии № 52-20554,

кл. С 12 К 9/00, 1977 (прототип).