Способ получения каллусной культуры змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) в условиях in vitro Российский патент 2020 года по МПК C12N5/04 

Изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть использовано в фармацевтической промышленности для получения сырья, содержащего ценные биологически активные соединения (флавоноиды, фенольные соединения), а также при введении в культуру in vitro других представителей лекарственных растений, получение которых затруднено из-за высокого содержания в своем составе летучих эфирных соединений.

Змееголовник дланевидный Dracocephalum palmatum Steph.– растение семейства Lamiaceae, многолетнее вечнозеленое растение с ползучими побегами, образует очень плотную дернину. Листья и побеги опушены. Цветоносы приподнимаются над дерниной на 10-15 см. Цветки фиолетовые в мутовках. Семена созревают в июле. Зимует с зелеными листьями. Встречается в северо-восточных районах Якутии. Растет на сухих каменисто-щебнистых склонах, скалах, в каменистых тундрах, гонных степях (см. Данилова Н.С., Борисова С.З., Иванова Н.С. Декоративные растения Якутии: Атлас-определитель. – М.: ЗАО «Фитон+», 2012. – 248 с).

Известно, что на основе химических и спектральных работ из частей змееголовника дланевидного было выделено 23 соединения (фенилпропаноиды, кумарины, флавоноиды и тритерпены), среди которых впервые в роду Dracocephalum было обнаружено восемь соединений: сальвианоловая кислота B, кафтаровая кислота, цихоровая кислота, умбеллиферон, эскулетин, апигенин-7-O-β-D-глюкуронопиранозид, изорхоифолин и лютеолин-4'-O-β-D-глюкопиранозид (см. Olennikov DN, Chirikova NK, Okhlopkova ZM, Zulfugarov IS. Chemical composition and antioxidant activity of Tánara Ótó (Dracocephalum palmatum Stephan), a medicinal plant used by the North-Yakutian nomads. Molecules.2013 Nov 14;18(11):14105-21.). 

Змееголовник дланевидный используют в тибетской медицине, якутской народной медицине, настой из надземной части и цветков применяют при язвенной болезни желудка, а в Средней Азии - при сердечной недостаточности, астении, болезнях желудка и как потогонное средство.

Известен способ получения каллусной культуры представителя семейства Lamiaceaе шлемника андрахновидного (Scutellaria andrachnoides) (см. ЕА №020503, кл. C12N 5/04, A01H 4/00, опубл. 28.11.2014), включающий получение штамма культуры корня растения шлемника андрахновидного (Scutellaria andrachnoides), интенсивно растущего в условиях in vitro на безгормональных питательных средах, сохраняющего способность к синтезу фенольных соединений, характерных для корней целого растения, и обладающего генетической и биохимической стабильностью.

Авторами в открытых источниках технические решения по получению каллусной культуры клеток змееголовника дланевидного не выявлено.

Задачей настоящего изобретения является получение каллусной культуры клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) в условиях in vitro.

Для решения поставленной задачи способ получения каллусной культуры клеток дикорастущего растения змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) в условиях in vitro включает стерилизацию семян змееголовника раствором перекиси водорода (3% раствор) в течение 5 минут, этиловым спиртом (80% раствор) в течение 1 мин, трехкратное ополаскивание в стерильной дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов следующего состава, в мг/л: NH₄NO₃ - 33000, KNO₃ - 38000, CaCl₂×2H₂O - 8800, MgSO₄×7H₂O - 7400, KH₂PO₄ - 3400, KI - 166, Н₃ВО₃ - 1240, MnSO₄×4H₂O - 4460, ZnSO₄×7H₂O - 1720, Na₂MoO₄×2H₂O - 50, CuSO₄×5H₂O - 5, CoCl₂×6H₂O - 5, FeSO₄×7H₂O - 5560, Na-ЭДТА - 7460, мезоинозит - 100, никотиновая кислота - 100, пиридоксин - 100, тиамин - 100, сахароза - 2500, вода - 1000 мл, агар - 7000. Далее, полученные из проростков листовые экспланты помещают в питательную среду следующего состава, в мг/л: NH₄NO₃ - 33000, KNO₃ - 38000, CaCl₂×2H₂O - 8800, MgSO₄×7H₂O - 7400, KH₂PO₄ - 3400, KI - 166, Н₃ВО₃ - 1240, MnSO₄×4H₂O - 4460, ZnSO₄×7H₂O - 1720, Na₂MoO₄×2H₂O - 50, CuSO₄×5H₂O - 5, CoCl₂×6H₂O - 5, FeSO₄×7H₂O - 5560, Na-ЭДТА - 7460, мезоинозит - 100, никотиновая кислота - 100, пиридоксин - 100, тиамин - 100, сахароза - 3000, гидролизат казеина - 500, кинетин - 1, 2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота - 1, вода - 1000 мл, агар - 12000. При этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели.

Анализ признаков заявленного решения свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна», каллусная культура змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) впервые получена в условиях in vitro.

Совокупность существенных признаков обеспечивает решение заявленной технической задачи, а именно, получение каллусной культуры змееголовника дланевидного(Dracocephalum palmatum Steph.).

Предлагаемое решение состоит в том, что за основу взяты стерильные свежие проростки, культивируемые в контролируемых условиях климатической камеры из семян интактного растения, фитомасса которого собрана во время стационарно-маршрутных работ на территории Оймяконского нагорья в Республике Саха (Якутия), известного как «Полюс холода – Оймякон», в фенофазах «конец цветения, начало плодоношения».

При этом отобранные семена стерилизовали раствором 3 % перекиси водорода в течение 5 минут, после чего, вторично 80 % спиртом в течение 1 мин. После стерилизации материал трехкратно ополаскивали стерильной дистиллированной водой. Стерилизованные семена помещали на твердую питательную среду без гормонов. Культивирование проростков проводили до третьего-пятого настоящих листьев в течение трех недель.

Питательная среда Мурасиге-Скуга для культивирования свежих проростков растения содержит компоненты в количественном соотношении, представленном в таблице 1.

Из полученного проростка получали листовые экспланты, которые помещали в питательную среду с дополнительным добавлением гидролизата казеина, кинетина, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. При этом выявлено, что наиболее интенсивное каллусообразование получается при концентрации фитогормонов кинетин 1 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты 1 мг/л.

После образования каллусной ткани проводили его отделение и рассадку в культуральные сосуды (чашки Петри, конически колбы на 100 и 250 мл) со свежей питательной средой, того же состава.

Питательная среда Мурасиге-Скуга для получения каллусной ткани содержит компоненты в количественном соотношении, представленном в таблице 2.

Культивирование проводили в темноте, при 26±1°С, влажности помещения 70±5%, в чашках Петри с диаметром 90 мм. При этом цикл субкультивирования составлял 4 недели. При пересеве использовали ¼ каллусной культуры.

Пересадку проводили каждые 30 дней, таким образом, сохраняя полученную каллусную культуру. В процессе культивирования определяли морфологические, цитологические характеристики, также отбирали для молекулярных исследований и химических анализов.

Описание способа получения каллусной культуры Dracocephalum palmatum Steph. в настоящее время нигде не зарегистрировано.

Полученная каллусная культура характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки: каллусные культуры рыхлые и зернистые, имеют желтовато-серую окраску.

Индекс роста (кратность прироста биомассы за одно субкультивирование) определяют по сырому и сухому весу биомассы. Для определения веса сырой биомассы каллусных культур отделяют от среды культивирования на бумажных фильтрах и взвешивают. Сухую биомассу каллусных культур получают после лиофильной сушки.

При анализе представленных кривых роста следует отметить замедление роста на 20 сутки культивирования, что позволяет использовать 4-недельный цикл выращивания. Ростовые параметры (кроме индекса роста) рассчитывали по сырому весу биомассы. Результаты представлены в таблице 3 и свидетельствуют о наличии стабильных ростовых характеристик.

Таким образом, выявлен способ получения каллусных культур змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) из эксплантов проростков, полученных в лабораторных условиях.

Таблица 1

Состав питательной среды Мурасиге-Скуга для культивирования проростков к получению стерильных эксплантов, в мг/л

Компоненты Содержание NH₄NO₃ 33000 KNO₃ 38000 CaCl₂x2H₂O 8800 MgSO₄x7H₂O 7400 KH₂PO₄ 3400 KI 166 H₃BO₃ 1240 MnSO₄x4H₂O 4460 ZnSO₄x7H₂O 1720 Na₂MoO₄x2H₂O 50 CuSO₄x5H₂O 5 CoCl₂x6H₂O 5 FeSO₄x7H₂O 5560 Na-ЭДТА 7460 Мезоинозит 100 Тиамин 100 Пиридоксин 100 Никотиновая кислота 100 Сахароза 2500 Вода 1000 мл Агар 7000

Таблица 2

Состав питательной среды Мурасиге-Скуга для получения каллусной культуры клеток

Компоненты Содержание, в мг/л NH₄NO₃ 33000 KNO₃ 38000 CaCl₂x2H₂O 8800 MgSO₄x7H₂O 7400 KH₂PO₄ 3400 KI 166 H₃BO₃ 1240 MnSO₄x4H₂O 4460 ZnSO₄x7H₂O 1720 Na₂MoO₄x2H₂O 50 CuSO₄x5H₂O 5 CoCl₂x6H₂O 5 FeSO₄x7H₂O 5560 Na-ЭДТА 7460 Мезоинозит 100 Гидролизат казеина 500 Тиамин 100 Пиридоксин 100 Никотиновая кислота 100 Сахароза 30000 Кинетин 1 2,4-Д 1 Вода 1000 мл Агар 12000

Таблица 3

Ростовые параметры каллусных культур змееголовника дланевидного

Показатели Значения, г Индексы роста по: весу сырой биомассы 0,0867 Удельный рост по весу сырой биомассы, сут -1 0,0043

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения каллусной культуры клеток дикорастущего растения змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян змееголовника раствором 3% перекиси водорода в течение 5 минут, 80% этиловым спиртом в течение 1 мин, трехкратное ополаскивание в стерильной дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов следующего состава, мг/л: NH₄NO₃ - 33000, KNO₃ - 38000, CaCl₂×2H₂O - 8800, MgSO₄×7H₂O - 7400, KH₂PO₄ - 3400, KI - 166, Н₃ВО₃ - 1240, MnSO₄×4H₂O - 4460, ZnSO₄×7H₂O - 1720, Na₂MoO₄×2H₂O - 50, CuSO₄×5H₂O - 5, CoCl₂×6H₂O - 5, FeSO₄×7H₂O - 5560, Na-ЭДТА - 7460, мезоинозит - 100, никотиновая кислота - 100, пиридоксин - 100, тиамин - 100, сахароза - 2500, вода - 1000 мл, агар - 7000. Далее, полученные из проростков листовые экспланты помещают в питательную среду следующего состава, мг/л: NH₄NO₃ - 33000, KNO₃ - 38000, CaCl₂×2H₂O - 8800, MgSO₄×7H₂O - 7400, KH₂PO₄ - 3400, KI - 166, Н₃ВО₃ - 1240, MnSO₄×4H₂O - 4460, ZnSO₄×7H₂O - 1720, Na₂MoO₄×2H₂O - 50, CuSO₄×5H₂O - 5, CoCl₂×6H₂O - 5, FeSO₄×7H₂O - 5560, Na-ЭДТА - 7460, мезоинозит - 100, никотиновая кислота - 100, пиридоксин - 100, тиамин - 100, сахароза - 3000, гидролизат казеина - 500, кинетин - 1, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота - 1, вода - 1000 мл, агар - 12000. При этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели. Изобретение позволяет получить каллусную культуру змееголовника дланевидного в условиях in vitro (Dracocephalum palmatum Steph.), которая может быть использована в качестве источника флавоноидов терапевтического действия. 3 табл.

Способ получения каллусной культуры змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян змееголовника перекисью водорода в течение 10 мин и этиловым спиртом в течение 1 мин, ополаскивание, трехкратное отмывание в течение 5 мин в стерильной дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов, следующего состава:

NH₄NO₃ 33000 мг KNO₃ 38000 мг CaCl₂x2H₂O 8800 мг MgSO₄x7H₂O 7400 мг KH₂PO₄ 3400 мг KI 166 мг H₃BO₃ 1240 мг MnSO₄x4H₂O 4460 мг ZnSO₄x7H₂O 1720 мг Na₂MoO₄x2H₂O 50 мг CuSO₄x5H₂O 5 мг CoCl₂x6H₂O 5 мг FeSO₄x7H₂O 5560 мг Na-ЭДТА 7460 мг Мезоинозит 100 мг Тиамин 100 мг Пиридоксин 100 мг Никотиновая кислота 100 мг Сахароза 2500 мг Вода 1000 мл Агар 7000 мг

дальнейшее помещение эксплантов растений, полученных in vitro, в питательную среду следующего состава:

NH₄NO₃ 33000 мг KNO₃ 38000 мг CaCl₂x2H₂O 8800 мг MgSO₄x7H₂O 7400 мг KH₂PO₄ 3400 мг KI 166 мг H₃BO₃ 1240 мг MnSO₄x4H₂O 4460 мг ZnSO₄x7H₂O 1720 мг Na₂MoO₄x2H₂O 50 мг CuSO₄x5H₂O 5 мг CoCl₂x6H₂O 5 мг FeSO₄x7H₂O 5560 мг Na-ЭДТА 7460 мг Мезоинозит 100 мг Гидролизат казеина 500 мг Тиамин 100 мг Пиридоксин 100 мг Никотиновая кислота 100 мг Сахароза 30000 мг Кинетин 1 мг 2,4 Д 1 мг Вода 1000 мл Агар 12000 мг

при этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели, при пересеве используют ¼ каллусных биомасс, полученные каллусные культуры сохраняют пересадкой каждые 30 суток.