Способ определения активности дегидрогеназ крови Советский патент 1983 года по МПК G01N33/50 C12Q1/66 

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю- , крови, разбавл.енную в 10щ и и с я тем, чуо в качестве иссле- 1000 раз в количестве дуемой жидкости используют сыворотку 0,005-1 мл. ,

1043568

. , ; . . . Изобретение ртносится к способам определения ферментов и может быть применено,в микробиологической и -медицинской отраслях промышленности, гематологии, физиологии и аналитической химии. .

ИзЬестны различные способы определения лак тив нос тиде гидрогена 3, основанные на проведении ферментативной реакции с последующим учетом пррДуктов реакции либо регистрацией про исходящих в ходе ее сопутствующих явлё:ний. Применяемые способы условно могут быть охарактеризованы как колориметрический, спектрЬфотрметрический и биолкялйнесцентный.

Известен наиболее чувствительны и перспективный биолюминвсцентный Способ, заключающийся в смещении раст-вора анализируемой дегид.рогеназы с никртинамидадениндинуклеотидом (НАД), субстратом, иммобилизованными НАДН, ФМН-Оксидоредукт азой и бактериальной . J цифepaзoй и регистрации биолюмин ес.ценции, по уровню которой судят об активности фермента дегидрогеназы. Чувствительность способа при анализе .чистых растворов индивидуальных дегидрогеназ 10 -10моль ,1 .

Недостатки Дан:н6го способа г- невысокая стабильность фермента (фермент в иммобилизованном виде стабилен де ёолёе 1,5-2 мес.), а также невозможность использования в анализе смеси веществ в биологических тканях вследствие, подверженности денатурации. I Данный способ при анализе дегид. рогеназ в смеси веществ сыворотки КРОВИ оказывается малопригодным . всл ствие побочных влияний компо ентов. сыворотки на люциферазу.. Чувствихельность способа в таких средах Значительно ниже, чем в чистых раст вррах -индивидуальных дегидрогеназ, а воспроизводимость результатов не:удовлетворительна/ что делает способ, малопригодным для использования в естественных биологических средах . : Наиболее близким к изобретению по достигаемому результату является спектрофотометрический способ определения активности дегидрогеназ кровиг Щредусматривающий инкубацию исслед}гемрй жидкости с субстратом оп:ред1еляёмого (77,5 мМ) в при сУтстеий НАД (6,25 ММ) в буферной среде при рН 8,8 с по :ледуюцим пект

рофотометрированием образукадегося восстановленного НАД, по ко 1ичеству которого определяют активность дегидрогеназы 2.

Известный способ позволяет работать со сложными естеств.енными биоло. гцческими жидкостями, однако н обладает следующими недостатками -. невысокой чувствит |Льностью (не выше 10 моль НАДН), невысокой надежностью (сцектрофотометрирование в присутст-j

; ВИИ посторонних дегидрогеназ в анализируемом растворе) , неэкономичностью (для применения способа необходима дорогостоящая высокочувствительная

:спектральная аппаратура). целью изобретения йвляется повышение чувствительности способа опреде ЛеНИЯ.-;; ; ,;,. / , /

i Поставленная цель достигается тем что согласно способу определения активности дегидрогвназ крови, предус|матривающему инкуба.цию исследуемой жидкости с субстратом определяемого фермента в присутствии «икотинамид-н . адениндинуклеотида в буферной среде,, инкубацию рсуществляют при рН 7,0-8,5 при содержании субстрата в чСмесиЮ|10 М, никоТИнамидадениндинуклеотвДа 10 -10 Ми при дополнительном введеНИИ в инкубационную среду алифатического эльдегида-деканаля в крли- У ;честве Ю -10 М, флавинмононуклео;Тнца - М и раствора бактериальной люциферазы Photobacterium fischeri с общим содержанием белка . 1 Ю -1,0 мг, с последукядим «змере;нием уровня биолюминесценции смеси, по кoтopo 4y с помсацью калибровочной кривой определяют активность фермен-, Та., - . . .:.: / . ,;. -; , . , Причем в качестве исследуемой жидкости используют сыворотку крови, разбавленную в 10-1000 раз в количестве 0,005-1 мл.

Способ осуществляют следующим образом.. -. / :. / - -,

Берут сыворотку крови,, разбавляют ее в 10-1000 раз, смешивают 0,0051 мл разбавленной сыворотки крови с люцйферазиой смесью, содержащей нико11та «(Ш эиаениндинуклеотид (НА.д} конечной концентрации 0,0001 - 17701 Ш 0,01 - 0,1 мл.алифатического альдегида - с коначвой крнцентраодвй Mr 0,,1 МП флаайй- монрнуклеотшха с конечной концентрацаей .10 -10-М; ,1 мп бактериальной люциферазы с конечной концентрацией по белку 0,01-10 мг в 0,1-1,0 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,0-8,5), добавляют субстрат ана лизируемой дегидрогеназы конечной концентрации 0,001-0,05 М и определяют уровень биолюминесценции :меси за 1 - 5 мин. Предлагаемый способ требует незна чительных количеств крови (для анализа достаточно 10 мкл разбавленной в 100 раз сыворотки или лиофилиэфван ной плазмы крови), чувствительность его выше, чем у известньах (спектррскопических и флуориметрических) , для анализа дегидрогеназ в крови в 100-100-0 раз, а проведение способа требует незначительных затрат времени. На фиг. 1 изображена зависимость ,интенсивности биолюминесценции люцифераэной смеси от увеличения концентрации сБ вороткикро и в присутствии лалтата (что характеризует активност лактатдегиярогейазы крови); на фиг.2 , зависимость интенсивности биолюми- нерценции люциферазной смеси от увеличения концентраций лиофилизованной плазмы крови в присутствии малата (что характеризует /активность малатдегидрогеназы); на фиг. 3 - зависимость интенсивности биолюминесцён цйи люциферазной смеси, от увеличения кон центрации лиофилизованной плазмы кро ви, предварительно подвергнутой йагрёваиию до бО и 65 в присутствии лактата -(что .характеризует активност изрфермецтрв, лактатдегидрогеаазы) .. Бактериальную люциферазу .получают на основе изв.естного способа (31. Бактерии выращивают на среде, содержащей, г/л пептон 1О, глицерин 3 мл дрожжевой экстракт 2 NaCl 30; Na2HPO .5,3; KH2PO42,lj . (NH4 ), НРОд 0,5; MgS04 0,1, рН 7,.4 при , 0.одержании кислорода 4-10% в течение 16 ч, сепарируют, разрушают под прес сом при температуре жидкого азота, . гсроматографируют на ирнооЪменнике flEAE 50 в 20-50%-ном этиленгликолевом буфере и либо перерастворяют в О,05 М триэтиламин-НС1 буфере, добав ляя BSA 0,1 мг/мл, и лиофилизируюф, либо осаяздают 80%-ным сульфатом -аммония и хранят при -20С. . Способ позволяет получать преда- рат люциферазы с высокой стабильное;ть«, T.ei препарат тпоциферазы в яйофйлйзованном виде теряет за год. при хранении при актив-ность до. , препарат в сульфате аммония npjj хранении в тех же условиях йр«к-г тически не теряет в течение года своей активности. П р и М е р 1. Определение активности лактатдегидрогеназы в сыврротке крови человека при использовании лиофилизоваНного препарата бактериальной люциферазы с содержанием белка 0/1 мг/мл с удельной активностью Ю квант/с, мг белка. Приготавливают растворы фосфатного буфера, бактериальной люциферазы в фосфатном буфере, субстрата анализируемой дегщцрогеназы, НАД, ФМН, альдегида-деканаля, сыворотки крови человека в. различных разведениях в фосфатном буфере. Берут набор стеклянных стаканчиков. (5-20 шт.) и во всех стаканчиках готовят люциферазную смесь, содержащую 600 мкл 0/1 М Ng-фосфатногр буфера (рН 8,0), 10 мкл 0,01 М НАД, 40 мкл 0,001 М ФМН, 100 мкл лактата Na, 0,1 М люциферазу {0,1 мг/мл).В стаканчик с люциферазной смесью, содержащей субстрат анализируемой : дегидрогеназы - лак-тат, добавляют 10 разбавленной сыворотки крови, помещают в кюветное отделение фото- . ме.тра с детектором света и определя- ют интенсивность люминесценции смеси за определенный промежуток времени (1 мин). Интенсивность люминесценции выражают в милли(макрр) вольтах или в квантах в секунду (1 мВ равен 10 10 ° KB ант/с) . Получе нную интенсивность люминесценции, используя калибровочную кривую люминесценции от НАДН, выражают в единицах активности фермента - моль НАДН/мин/мл. На фиг. 1 приведена зависимость интенсивности биолюминесценции люциферазной смеси и активности лактат- дегидрогеназы от концентрации сыворотки крови человека. Видно, что с увеличением концентрации сыворотки линейно увеличивается интенсивность биолюминесценции. Таким образом, мож-. но сделать вывод, что, например, 0,04% раствор сыворотки крови содерт ;чшт лактатдегидрогеназу, вызывающую увеличение: люминесценции смесина 35 мВ (5,5 «10 KB ант/с), что соответствует изменению активности лактатдегидрогеназы на 7 10 моль НАДН/ мин/мл,; П, р и ме р 2. Определение-активности малатдегидрогеназы крови челрвека при использовании лиофилизован- ного препарата бактериальной люииферазы с срдержанием белка 0,1 .wi, е удельной активностью 1о квад1т/с лг белкам; Препарат людиферазы получают .аналогично примеру 1. Люциферазнал сМесь готовится из тех же веществ и той. же пропорции, чтои в примере 1, с той лишь разницей, что в качестве субстрата анализируемой дегидрогеназы дрбавляют 10 мкл малата с конечнрй крнцентрацией 10 мМ. В стаканчик с Люциферазнрй смесью/ срдержащей.малат, вносят сыворотку . крови и измеряют уровень люминесценции за 1 мин. Пр калибровочной

кривой интенсивность люминесценции в МИЛЛИ(микро) вольтах выражают в единицах активности фермента НАДН/мин/мл. . ,

На фиг 2 приведена зависимость интенсивности люминесценции люцифераэыой смеси, с малатом от концентраций сыворотки крови. Видно, что добавление. 0,2% раствора сыворотки крови вызывает возраста:ние .люминесценции смеси на 5 мВ, что соответствует изменению активности мала1тдегидрогеназы яа НАДН/мин/мл.

Приме р 3. Определение активности изоферментов лактатдегндрогеназы в лиофилиэованной плазме крови человека с помощью препарата бактериальной люциферазы в сульфате аммония с содержанием белка 0,2 мг/мл с удельной активностью 10 квант/с«мг белка. :

Препарат люциферазы получен из бактерий/ вЕфащенных в описанных условиях, отличающихся тем, что, посде хроматографирования на ионообменнигке ДБАБ-50 и переоса}кдения в триэтилН&1 буфер, препарат подвергается высаливанию 80%-ным сульфатом аммония, осгикдается центрифугированием при 18000 и хранится при -20°С в сульфате с1ММОНИЯ.

Берут лиофилизованную плазму кро.ви, растворяют её в 0,1 М фосфатном буфере, помацают раствор .плазмы крови в термостат и выдерживают. 15 мин при 60°С (получают термостабильные изоферменты лактатдег-идрогеназы ЛД-1,2) или при (получают термостабильный изофермент ЛД-1, после чего подвергают плазму быстрому охлаждению во льду.

Полученную плазму крови,добавляют к люциферазной , приготовлен ной по методике, описанной в примере

1, и измеряют уровень люминесценции смеси, по которому судят об активности изо(1 ерментов лактатдегидрогеназы. На фиг. 3 приведена зависимость интенсивности люминесценции рмеси от .концентрации плазмы, прогретой до 60

(кривая 1) и до 65°(кривая 2) в присутствии лактата - 11а.

Видно, что с увеличением концентра1ции плазмы крови линейно возрастает активность люминесценции. .Увеличение концентрации плазмы на 0,4 мг/мл вызывает возрастание люминесценции на 18 мВ (ЛД-1) или на 35 MB (ЛД-1,2) Это изменение .люминесценции смеси соответствует изменению активности ЛД-1,2 на 2,310- моль НАДН и ЛД-1,3 на 4 ,5 10 моль НАДН/мин/мл.

Изобретение,обеспечивает повышение чуствительности способа (по сравнению с известными способами определения активности дегидрогеназ крови предлагаемый позволяетповысить чувствительность до 10 10 моль), повышение зкономичности способа (препарат люциферазы для указанных целей . получают по.простой методике очистки, что удешевляет препарат), на измерение активности ферментов исполь- зуют незначительные количества сыворотки или .пирфилизованной плазмы крови. Препарат не подвергается денатутрирукщему воздействию компонентов крови, что позволяет использовать его для анализа в смеси веществ. Препарат люциферазы эффективен в широком диапазоне рН и температур (рН 5,5 -8,.5гТ°- 5-25с), что существенно расширяет возможности его применения. Предл1агаемые для использования в анализе препараты .пюциферазы обладают устойчивой кинетикой свечения и высокой стабильностью..

(;

i ем/ 2,0 MrJNn-(плазм 1.2 W Фиг.З }