Способ определения никотинамидадениндинуклеотида окисленного Советский патент 1987 года по МПК C12Q1/66 

1 11

Изобретение относится к бнохимн- чс-скому анализу, касается способа ферментативного количественного определения никотинамидадениндинуклеоти ца окисленного () и может быть лспользовано для анализа в сложных смесях и различных биологических жидкостях,

Цель изобретения - снижение предела обнаружения НАД.

Способ осуществляется следующим образом.

Регистрируют интенсивность биолюминесценции, возникающей в результате протекания трехстадийной реакции, катализируемой трехферментной системой, включающей НАД -зависимую дегидрогеназу, НАДН,, : ФМН-оксидоре- дуктазу и бактериальную люциферазу. Ферменты предварительно соиммобили- зуют на сефарозе, активированной бромцианом в присутствии О,,3 М форми ата натрия Изменение концентрации формиата натрия по сравнению с указанной приводит к снижению удельной активности иммобилизованных ферментов и чувствительности определения . Для проведения анализа к суспензии соиммобилизованных ферментов в буферном растворе при рН 6-7, от- веча ющем рН оптимуму действия трех- ферментной системы, добавляют субстраты всех используемых фе рментов и анализируемый раствор, содержащий . Предел обнаружения в измеряемой смеси.

Пример 1. Лиофилизованную BrCN агарозу 4В замачивают на 3 ч в дистиллированной воде. Полученный гель промывают последовательно 1 мМ раствора НС1 (200 мл НС1 на 1 г геля), 200 мл бидистиллированной воды, 0,1 М бикарбонатным буфером, содержащим 0,5М NaCl, бидистиллированной водой и 0,1 М Na-фосфатным буфером.

Готовят 3 мл раствора ферментов: формиатдегидрогеназы из бактерий Pseudomonas Sp 101, № ВКМ В-15А5Д - институт Микробиологии АН СССР, НАДН :ФМН-оксидоредуктазы и люцифе- разы из бактерий Beneckea harveyi в 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 7,5, с концентрацией белка 3 мг/мл и активностью 1000 мВ/мг белка. К полученному раствору добавляют 200 мг носителя и формиат натрия до концентрации 0,3 М. Суспензию перемешивают п качалке 20 ч при Д С. Полученные

55702

образцы отм)1вают попеременно кислыми (100 мл) и щелочными (100 мл) компонентами 0,1 М Na-фосфатного буферного раствора до исчезновения ферментативной активности в промывных водах. Отмытые образцы суспендируют в 5 мл 0,1 М Na-фосфатного буфера, рН 7,0, содержащего 0,1 мМ дитиотреитол, 10 и хранят при 4 С. Удельная активность полученных препаратов 200-1000 мВ/мг.

Пример 2, Иммобилизация проводится так же, как в примере 1, но инкубационная смесь содержит

15 0,25 М формиат натрия. Удельная активность получаемых препаратов 20- 100 мВ/мг агарозы.

Пример 3. Иммобилизация проводится так же, как в примере 1,

20 но инкубационная смесь содержит

0,35 М формиат натрия. Удельная активность получаемых препаратов 40- 200 мВ/мг агарозы.

Пример 4. Для получения ка25 либровочного графика в интервале концентраций 1 пм-1 мкМ используют одну и ту же пробу иммобилизованного препарата. В кювету люминометра вносят реагенты, указанные в табли30 це за исключением НАД и измеряют фоновое свечение. Затем последовательно вносят по 20 мкл раствора в концентрациях О, 125, 1,25, 12,5, 1250, 12500 нМ, переходя от меньших

2g концентраций к большим, и каждый раз измеряют интенсивность биолюминесценции. В данном .эксперименте при добавлении раствора используют небольшие объемы (20 мкл). Поэтому не

40 происходит существенного разбавле- .ния реакционной смеси и изменения концентрации реагентов при добавлении нескольких порций НАД в одну и ту же реакционную смесь.

,f- В таблице дан состав реакционной смеси при проведении регистрации .

Калибровочная кривая представляет собой прямую в интервале концентраций НАД 1 пМ-0,1 мкМ. Калибровочную прямую обрабатывают по методу наименьших квадратов, Получают уравнение

Y 0,51 X .5,8,

где Y Ig (интенсивность свечения) (концентрация НАД).

Повторяют определение, вводя в реакционную смесь 20 мкл 125 нМ НАЛ . Получают интенсивность свечения

15,7 мВ, что соответствует концентрации НАД в реакционной смеси 0,91 . Ошибка определения 9%.

Пример 5. Калибровочную кривую для определения НАД при рН 7,0 получают так же, как в примере 4, ис- пользуя 50 мН Na-фосфатный буфер с рН 7,0, Линейная зависимость между концентрацией HAfl и интенсивностью свечения соблюдается в пределах 10 пМ - 0,1 мкМ НАД.

Пример 6, Калибровочную кривую для определения HAfl при рН 6,0 получают так же , как в примере 4, ис- пользуя 50 мМ Na-фосфатный буфер с рН 6,0 вместо 6,5. Линейная зависимость между концентрацией и интенсивностью свечения соблюдается в .пределах 5 пМ-0,1 мкМ НАД.

Суспензия: 40 мг иммобилизованного ферментного препарата в 1 мл О,1 М Na-фосфатного буфера, рН 7,0

50 мМ Na-Фосфат- . ный буфер, рН 6,5

Редактор И, Горная

Составитель Л. Борисова

Техред В.Кадар Корректор А. Обручар

Заказ 4018/22 Тираж 499Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

111)011чп(1)гс тврнтю-полиграфт ческое прелприятие, г. Ужгород, ул. IpocK i н.эя,

д

Формула изобретения

Способ определения никотинамида- дениндинуклеотида окисленного, пре- дусматривакщий регистрацию биолюминесценции, возникающей в результате трехстадийной реакции, катализируемой трехферментной системой, получаемой соиммобилизацией НАД -за- висимой дегидрогеназы, ФМН- оксидоредуктазы и бактериальной люци- феразы, отличающийся тем, что, с целью снижения предела обнаружения, в качестве НАД -зависимой дегидрогеназы используют формиат- дегидрогеназу, процесс соиммобилиза- ции ведут в присутствии 0,3 М форми- ата натрия и регистрацию осзпцествля- ют при рН 6-7,

4 10 мВ/мл О, 1 2,0

1,6 .-Ю мБ/мл

Изобретение относится к области биохимического анализа, касается способа ферментативного количественного определения никотинамидадениндинукле- отида окисленного () и может быть использовано для анализа НАД в сложных смесях и различных биологических жидкостях. Цель изобретения - снижение предела обнаружения НАД. Способ осуществляется путем регистрации интенсивности биолюминесценции, возникающей в результате протекания трех- стадийной реакции, катализируемой трехферментной системой, включающей НАЯ -зависимую дегидрогеназу, ФМН-оксидоредуктазу и бактериальную люциферазу. Для проведения анализа к суспензии соиммобилизованных ферментов в буферном растворе при рН 6-7, отвечающем рН оптимуму действия трехферментной системы, добавляют субстраты всех используемых ферментов и анализируемый раствор, содержащий НАД. Предел обнаружения НАД составляет в измеряемой смеси. 1 табл, (Л со оо сд СП -vj