Способ определения активности гликогенфосфорилазы Советский патент 1989 года по МПК C12Q1/66 

Изобретение относится к биохимическому анализу, а именно к способу определения активности гликоген- фосфорилазы, и может быть использовано для определения гликогенфосфори- лазы в сыворотке крови.

Цель изобретения - повышение чувствительности определения, сокращение времени проведения анализа, расширение диапазона измеряемых активностей, упрощение процесса

Изобретение заключается в том, что используют четырехферментную систему, включающую: фосфоглюкомутазу. глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, ФМН-оксидоредуктазу и бактериальную

люциферазу, .которые предварительно соиммобилизуют на BrCN-агарозе.

Соиммобилизацию ферментов прово- дят путем инкубации буферного раствора с рН 7,5-8,0, содержащего фосфоглюкомутазу (20-200 Е/мп), глюко- зо-6-фосфатдегидрогеназу (10-100 Е/ /мл), НАДН : ФМН-оксидоредуктазу (2-20 Е/мл) и люциферазу (20-200 Е/ /мл) с суспензией BrCN-агарозы.

Указанный диапазон активностей ферментов, используемый для анализа,, является необходимым условием дости- жания высокой чувствительности анализа.

4аь

СО Ч N9

СХ)

3149

Каждому значению активностей любого из четырех ферментов соответствуют определенные онтимальные значения активностей трех других ферментов, лежащие строго в указанных диапазонах. Использование ферментов с активностями, лежащими за пределами указанных диапазонов, приводит к снижению чувствительности анализа, поскольку зависимость активности иммобилизованных ферментов от их исходных активностей имеет ко- локолообразный характер.

Для проведения анализа может быть использован экстракт светящихся бактерий, получаемый фракционированием экстрактов бактерий Beneckea har- veyi сульфатом аммония от 50 до 100% насыщения,

Предл агаемый способ позволяет определять гликогенфосфорилазу в диапазоне активностей 0,01-10 Е, т.е. предел обнаружения снижается в пять раз по сравнению с известным и наблю дается необходимое для целей медицинской диагностики расширение диапазона измеряемых активностей. Достигаемое повышение чувствительности

0

5

0

1 мг/мп азида натрия, получают суспензию с содержанием носителя 100 мг/мп, которую хранят при . Для длительного хранения суспензию лиофилизуют порциями по О, 5 мл,Удельная активность получаемых препаратов 40 Е/мп агарозы.

Пример 2, Иммобилизацию проводят так же, как в примере 1 за . исключением того, что раствор ферментов содержит 200 Е/мл фосфоглю- комутазы,. 100 Е/мп глюкозо-6-фос- фатдегидрогеназы, 20 E/MJI НАДЫ : : ФМН-оксидоредуктазы и 200 Е/мл бактериальной люциферазы. Удельная активность получаемых препаратов 30 Е/мл агарозы.

Пример 3, Иммобилизацию проводят так же, как в примере 1 за исключением того, что раствор ферментов содержит 20 Е/мп фосфоглю- комутазы, 10 Е/кл глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы, 2 Е/мл НЛДН : ФМН- -оксидоредуктазы и 20 Е/мл бактериальной люциферазы. Удельная активность получаемых препаратов 20 Е/мп агарозы.

Пример 4, Иммобилизацию про

Изобретение относится к биохимическому анализу и может быть использовано для определения гликогенфосфорилазы в сыворотке крови. Целью изобретения является повышение чувствительности определения, сокращение времени анализа, расширение диапазона определяемых активностей и упрощение процесса. Изобретение состоит в том, что используют четырехферментную систему: фосфоглюкомутаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, НАДН₂: ФМН-оксидоредуктаза, бактериальная люцифераза, соиммобилизованную на BRCN -агарозе при PH 7,5 - 8,0, и процесс регистрации ведут люминесцентным способом по начальной реакции, катализируемой гликогенфосфорилазой. 1 табл.

анализа связано, по-видимому, с акти- 30 водят так же, как в примере 1 за

нацией полиферментной системы в соим мобилизованном состоянии.

Пример 1, Получение соиммо- билизованной четырехферментной системы.

Лиофилизованную BrCN-arapO3y замачивают на 3 ч в дистиллированной воде, затем промывают 1 мМ НС1 и О,1 М Na-фосфатным буферным раствором, рН 7,8. В 0,1 М Na-фосфатном буферном растворе, рН 7,8, готовят раствор ферментов с общей концентр.а- цией .белка 4-8 мг/мл, который содержит 100 Е/мл фосфоглюкомутазы, 50 Е/мл глюкозо-6-фосфатдегидроге- назы, 10 Е/мл НАДН : ФМН-оксидоредуктазы и 100 Е/мл бактериальной люциферазы. К полученному раствору добавляют BrCN-агарозу из расчета 100 мл/мл и полученную суспензию встряхивают на качалке 20 ч цри 4 С. Затем носитель промывают 0,1 М Na- -фосфатным буферным раствором, рН 7,0, содержащим 0,5 М NaCl, до исчезновения ферментативной активности в промывних водах. Носитель с иммобилизованными ферментами суспен- д1Фуют в 0,5 М трис-ацетатном буферном растворе, рП 6,0, содержащем

5

0

5

0

5

исключением того, что раствор ферментов готовят в 0,1 М Na-фосфатном буферном растворе, рН 7,57, Удельная активность получаемых препаратов 30 Е/мл агарозы.

Пример 5, Иммобилизацию проводят так же, как в примере 1 за ис1шючением того, что раствор ферментов готовят в 0,1 М Na-фосфат- ном буферном растворе, рН 7,0, Удельная активность получаемых препаратов 25 Е/мл агарозы.

Пример 6, Определение активности глюкогенфосфорилазы.

При определении активности гли- когенфосфорилазы в кювету люмино- метра последовательно вносят: 1 мл 0,05-М трис-ацетатного буферного раствора, рН 6,8-7,0, 0,05 мл раствора гликогенфосфорилазы, 0,05 мл раствора, содержащего 0,06 М ацетата магния, 30 мг/мл гликогена, 0,15 мМ глюкозо-1,6-дифосфата,Смесь инкубируют в те чение 8-12 мин при . Затем в кювету добавляют 0,05мл суспензии соиммобилизованной четырехферментной системы, приготовленной, как указано в примере 1, 0,1 мл 0,3 мМ раствора деканаля в 2%-ном

5

n-пропаноле, 0,05 мл 30 мМ раствора НАД в воде и регистрируют фоновое свечение. Добавляют 0,1 мл раствора 0,15 М фосфата и полученную смес инкубируют в течение 1 мин. Затем в течение 2 мин регистрируют увеличение интенсивности свечения при постоянном перемешивании. За меру активности гликогенфосфорилазы принимают тангенс угла наклона получаемой прямой (В/мин).

Указанная последовательность операций при проведении анализа, а именно раздельное добавление субстратов гликогенфосфорилазы (сначала гликогена, а затем после инкубации неорганического фосфата), необходима для стандартизации условий регистрации свечения. В противном случае не наблюдается воспроизводимости экспериментальных данных.

Перевод активности гликогенфосфорилазы в международные единицы (мкМ/мин) осуществляют по калибровочному графику зависимости свечения от концентра1Ц1и глюкозо-1-фосфата (продукта гликогенфосфорилаз- ной реакции).

Калибровочный график представляет собой прямую в интервале концентраций глюкозо-1-фосфата от 1 нМ до 10 мкМ. Калибровочную прямую обрабатывают по методу наименьших квадртов. Получают уравнение

у 1,00х - 8,20,

где у - Ig I (интенсивность свечения, В) ;

X - Ig С (интенсивность глюко- зо-1-фосфата, М).

Расчет активности гликогенфосфорилазы в ME (мкМ/мин) проводят по формул е

А k А ,

где А - активность гликогенфосфорилазы, ME;

А - активность гликогенфос- форилазы. В/мин;

. ,o---i -,

где V - объем реакционной смеси,

мл (1,5);

V - объем раствора гликогенфосфорилазы, мл (0,05).

7218

Проводят определение активности приготовленных растворов гликогеи- фосфорял азы. Результаты пр еле та вло ны нггже.

Введеую гликогенфосфо- Сигнал, рилазы, MEмВ/мит)

0,01 0,05 0,10 0,25 0,50 1 ,00 5,00 10,00

3,0 5,3 7,5 18 35

62,5 307 613

Получе1П{ые дан пле обработали по методу наименьших квадратов. Полу

чили уравнение: у 61,ОАх+2,А4, где у - сигнал (мВ/ьшн) ; х - введенное количество глико генфосфори- лазы (НЕ).

Оиплбка определения не превышает 15%.

Пример 7. Определение активности гликогенфосфорилазы В.

Определение активности гликогенфосфорилазы В проводят так же, как

и определение активности гликогенфосфорилазы, за счет иск.чючения того, что раствор, содержащий гликоген, ацетат магния и глюкозо-1,6- -дйфосфат, содержит еще 0,03 М AMP.

Соиммобилизованная система приготовлена, как указано в примере 1„ Введено 0,3 Е гликогенфосфорилазы. Определено 0,28Е гилкогенфосфорила- зы. Ошибка определения 10%.

Пример 8. Определение активности гликогенфосфорилазы в сыворотке крови.

Сыворотку крови пропускают через колонку, заполненную крахмалом. Крахмал (20 г) суспенидруют в 40 мл

0,02 М трис-ацетатного буферного раствора, содержащего 1 мМ дитиотреито- ла, и оставляют набухать в течение 2 ч при 4 С. В колонку (1x5 см) вносят 2 мл суспензии крахмала. Затем пипеткой 1 мл сыворотки крови. После нанесения сьшоротки крови в колонку вводят 2 мл 0,02 М трис- -ацетатного буферного раствора, рН

, затем элюируют гликогенфосфори- лаз.у 1 мл 0,05 М трис-ацетатного буферного раствора, рН 7,6, содержаще- го 10 мг/мл гликогена и 0,05 мМ ЭДМА, при 20 с.

Способ определения активности тликогенфосфорилазы, предусматрива- щнй использование четырехферментной системы, содержащей фосфоглюкомута10

Для очистки следутощей норщш сыворотки используют новую порцию крахмального геля,

Активность тликогенфосфорилазы в элюате определяют, как описано в примере 2, но вместо 1 мл трис-аце- татного буферного раствора и 0,05 мл раствора фермента используют 0,5 мл элюата с колонки и 0,5 мл трис-аце- татного раствора, рН 7,0, Использованная четырехфермЕнтная- соиммобили- зованная система г1риготовлеяа, кик указано в примере 1о Расчет активности гликогенфосфорилазы в НЕ проводят так же, как в примере 6, за исключением того,- что объем сыворотки 0,5 мл.

Формула иэобретения|20

1497218 8

ЗУ, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, оксидоредуктазу и бактериальную лю- циферазу, с последующей оценкой результатов биолюминесценцией, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности определе- 1ШЯ гликогенфосфорилазы, сокращения времени анализа, расширения диапазона измеряемых активностей и упрощения процесса, используют ферменты, соиммобилизованные на BrCN-агарозе при рН 7,5-8,0, при содержании фос- фоглюкомутазы 20-200 Е/мп, глюкозо- -6-фосфатдегидрогеназы 10-100 Е/мл, НАДН : ФМН-оксидоредуктазы 2-20 Е/ /мл и бактериальной люциферазы 20 - 200 Е/мп, определение ведут путем последовательного добавления к ана- лизиpyeмo ry образцу гликогена суспензии соиммобилизованных ферментов и их субстратов и затем неорганического фосфата,а результат оценивают по начальной скорости реакции, катализируемой глИкогенфосфори- лазой,

15

5