Изобретение относится к биохимическому анализу, а именно к способу определения активности гликоген- фосфорилазы, и может быть использовано для определения гликогенфосфори- лазы в сыворотке крови.
Цель изобретения - повышение чувствительности определения, сокращение времени проведения анализа, расширение диапазона измеряемых активностей, упрощение процесса
Изобретение заключается в том, что используют четырехферментную систему, включающую: фосфоглюкомутазу. глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, ФМН-оксидоредуктазу и бактериальную
люциферазу, .которые предварительно соиммобилизуют на BrCN-агарозе.
Соиммобилизацию ферментов прово- дят путем инкубации буферного раствора с рН 7,5-8,0, содержащего фосфоглюкомутазу (20-200 Е/мп), глюко- зо-6-фосфатдегидрогеназу (10-100 Е/ /мл), НАДН : ФМН-оксидоредуктазу (2-20 Е/мл) и люциферазу (20-200 Е/ /мл) с суспензией BrCN-агарозы.
Указанный диапазон активностей ферментов, используемый для анализа,, является необходимым условием дости- жания высокой чувствительности анализа.
4аь
СО Ч N9
СХ)
3149
Каждому значению активностей любого из четырех ферментов соответствуют определенные онтимальные значения активностей трех других ферментов, лежащие строго в указанных диапазонах. Использование ферментов с активностями, лежащими за пределами указанных диапазонов, приводит к снижению чувствительности анализа, поскольку зависимость активности иммобилизованных ферментов от их исходных активностей имеет ко- локолообразный характер.
Для проведения анализа может быть использован экстракт светящихся бактерий, получаемый фракционированием экстрактов бактерий Beneckea har- veyi сульфатом аммония от 50 до 100% насыщения,
Предл агаемый способ позволяет определять гликогенфосфорилазу в диапазоне активностей 0,01-10 Е, т.е. предел обнаружения снижается в пять раз по сравнению с известным и наблю дается необходимое для целей медицинской диагностики расширение диапазона измеряемых активностей. Достигаемое повышение чувствительности
0
5
0
1 мг/мп азида натрия, получают суспензию с содержанием носителя 100 мг/мп, которую хранят при . Для длительного хранения суспензию лиофилизуют порциями по О, 5 мл,Удельная активность получаемых препаратов 40 Е/мп агарозы.
Пример 2, Иммобилизацию проводят так же, как в примере 1 за . исключением того, что раствор ферментов содержит 200 Е/мл фосфоглю- комутазы,. 100 Е/мп глюкозо-6-фос- фатдегидрогеназы, 20 E/MJI НАДЫ : : ФМН-оксидоредуктазы и 200 Е/мл бактериальной люциферазы. Удельная активность получаемых препаратов 30 Е/мл агарозы.
Пример 3, Иммобилизацию проводят так же, как в примере 1 за исключением того, что раствор ферментов содержит 20 Е/мп фосфоглю- комутазы, 10 Е/кл глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы, 2 Е/мл НЛДН : ФМН- -оксидоредуктазы и 20 Е/мл бактериальной люциферазы. Удельная активность получаемых препаратов 20 Е/мп агарозы.
Пример 4, Иммобилизацию про
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
Способ определения никотинамидадениндинуклеотида окисленного | 1985 |
|
SU1335570A1 |
Способ определения изоферментной активности гликогенфосфорилазы | 1981 |
|
SU1008655A1 |
СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ У БОЛЬНЫХ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА ПОСЛЕ АОРТОКОРОНАРНОГО ШУНТИРОВАНИЯ | 2011 |
|
RU2466395C1 |
Способ определения НАД-зависимой формиатдегидрогеназы | 1987 |
|
SU1518376A1 |
Способ количественного определения адениновых нуклеотидов | 1985 |
|
SU1317027A1 |
БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ БИОМОДУЛЬ ДЛЯ АНАЛИЗА ТОКСИЧНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ СРЕД И СПОСОБ ЕГО ПРИГОТОВЛЕНИЯ | 2009 |
|
RU2413772C2 |
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СТАДИИ ОСТРОГО ПИЕЛОНЕФРИТА | 1994 |
|
RU2115124C1 |
Способ иммобилизации люциферазы светляков | 1977 |
|
SU660378A1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО МНОГОКОМПОНЕНТНОГО РЕАГЕНТА ДЛЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА | 2003 |
|
RU2252963C1 |
Способ определения активности дегидрогеназ крови | 1981 |
|
SU1043568A1 |
Изобретение относится к биохимическому анализу и может быть использовано для определения гликогенфосфорилазы в сыворотке крови. Целью изобретения является повышение чувствительности определения, сокращение времени анализа, расширение диапазона определяемых активностей и упрощение процесса. Изобретение состоит в том, что используют четырехферментную систему: фосфоглюкомутаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, НАДН2: ФМН-оксидоредуктаза, бактериальная люцифераза, соиммобилизованную на BRCN -агарозе при PH 7,5 - 8,0, и процесс регистрации ведут люминесцентным способом по начальной реакции, катализируемой гликогенфосфорилазой. 1 табл.
анализа связано, по-видимому, с акти- 30 водят так же, как в примере 1 за
нацией полиферментной системы в соим мобилизованном состоянии.
Пример 1, Получение соиммо- билизованной четырехферментной системы.
Лиофилизованную BrCN-arapO3y замачивают на 3 ч в дистиллированной воде, затем промывают 1 мМ НС1 и О,1 М Na-фосфатным буферным раствором, рН 7,8. В 0,1 М Na-фосфатном буферном растворе, рН 7,8, готовят раствор ферментов с общей концентр.а- цией .белка 4-8 мг/мл, который содержит 100 Е/мл фосфоглюкомутазы, 50 Е/мл глюкозо-6-фосфатдегидроге- назы, 10 Е/мл НАДН : ФМН-оксидоредуктазы и 100 Е/мл бактериальной люциферазы. К полученному раствору добавляют BrCN-агарозу из расчета 100 мл/мл и полученную суспензию встряхивают на качалке 20 ч цри 4 С. Затем носитель промывают 0,1 М Na- -фосфатным буферным раствором, рН 7,0, содержащим 0,5 М NaCl, до исчезновения ферментативной активности в промывних водах. Носитель с иммобилизованными ферментами суспен- д1Фуют в 0,5 М трис-ацетатном буферном растворе, рП 6,0, содержащем
5
0
5
0
5
исключением того, что раствор ферментов готовят в 0,1 М Na-фосфатном буферном растворе, рН 7,57, Удельная активность получаемых препаратов 30 Е/мл агарозы.
Пример 5, Иммобилизацию проводят так же, как в примере 1 за ис1шючением того, что раствор ферментов готовят в 0,1 М Na-фосфат- ном буферном растворе, рН 7,0, Удельная активность получаемых препаратов 25 Е/мл агарозы.
Пример 6, Определение активности глюкогенфосфорилазы.
При определении активности гли- когенфосфорилазы в кювету люмино- метра последовательно вносят: 1 мл 0,05-М трис-ацетатного буферного раствора, рН 6,8-7,0, 0,05 мл раствора гликогенфосфорилазы, 0,05 мл раствора, содержащего 0,06 М ацетата магния, 30 мг/мл гликогена, 0,15 мМ глюкозо-1,6-дифосфата,Смесь инкубируют в те чение 8-12 мин при . Затем в кювету добавляют 0,05мл суспензии соиммобилизованной четырехферментной системы, приготовленной, как указано в примере 1, 0,1 мл 0,3 мМ раствора деканаля в 2%-ном
5
n-пропаноле, 0,05 мл 30 мМ раствора НАД в воде и регистрируют фоновое свечение. Добавляют 0,1 мл раствора 0,15 М фосфата и полученную смес инкубируют в течение 1 мин. Затем в течение 2 мин регистрируют увеличение интенсивности свечения при постоянном перемешивании. За меру активности гликогенфосфорилазы принимают тангенс угла наклона получаемой прямой (В/мин).
Указанная последовательность операций при проведении анализа, а именно раздельное добавление субстратов гликогенфосфорилазы (сначала гликогена, а затем после инкубации неорганического фосфата), необходима для стандартизации условий регистрации свечения. В противном случае не наблюдается воспроизводимости экспериментальных данных.
Перевод активности гликогенфосфорилазы в международные единицы (мкМ/мин) осуществляют по калибровочному графику зависимости свечения от концентра1Ц1и глюкозо-1-фосфата (продукта гликогенфосфорилаз- ной реакции).
Калибровочный график представляет собой прямую в интервале концентраций глюкозо-1-фосфата от 1 нМ до 10 мкМ. Калибровочную прямую обрабатывают по методу наименьших квадртов. Получают уравнение
у 1,00х - 8,20,
где у - Ig I (интенсивность свечения, В) ;
X - Ig С (интенсивность глюко- зо-1-фосфата, М).
Расчет активности гликогенфосфорилазы в ME (мкМ/мин) проводят по формул е
А k А ,
где А - активность гликогенфосфорилазы, ME;
А - активность гликогенфос- форилазы. В/мин;
. ,o---i -,
где V - объем реакционной смеси,
мл (1,5);
V - объем раствора гликогенфосфорилазы, мл (0,05).
7218
Проводят определение активности приготовленных растворов гликогеи- фосфорял азы. Результаты пр еле та вло ны нггже.
Введеую гликогенфосфо- Сигнал, рилазы, MEмВ/мит)
0,01 0,05 0,10 0,25 0,50 1 ,00 5,00 10,00
3,0 5,3 7,5 18 35
62,5 307 613
Получе1П{ые дан пле обработали по методу наименьших квадратов. Полу
чили уравнение: у 61,ОАх+2,А4, где у - сигнал (мВ/ьшн) ; х - введенное количество глико генфосфори- лазы (НЕ).
Оиплбка определения не превышает 15%.
Пример 7. Определение активности гликогенфосфорилазы В.
Определение активности гликогенфосфорилазы В проводят так же, как
и определение активности гликогенфосфорилазы, за счет иск.чючения того, что раствор, содержащий гликоген, ацетат магния и глюкозо-1,6- -дйфосфат, содержит еще 0,03 М AMP.
Соиммобилизованная система приготовлена, как указано в примере 1„ Введено 0,3 Е гликогенфосфорилазы. Определено 0,28Е гилкогенфосфорила- зы. Ошибка определения 10%.
Пример 8. Определение активности гликогенфосфорилазы в сыворотке крови.
Сыворотку крови пропускают через колонку, заполненную крахмалом. Крахмал (20 г) суспенидруют в 40 мл
0,02 М трис-ацетатного буферного раствора, содержащего 1 мМ дитиотреито- ла, и оставляют набухать в течение 2 ч при 4 С. В колонку (1x5 см) вносят 2 мл суспензии крахмала. Затем пипеткой 1 мл сыворотки крови. После нанесения сьшоротки крови в колонку вводят 2 мл 0,02 М трис- -ацетатного буферного раствора, рН
, затем элюируют гликогенфосфори- лаз.у 1 мл 0,05 М трис-ацетатного буферного раствора, рН 7,6, содержаще- го 10 мг/мл гликогена и 0,05 мМ ЭДМА, при 20 с.
Способ определения активности тликогенфосфорилазы, предусматрива- щнй использование четырехферментной системы, содержащей фосфоглюкомута10
Для очистки следутощей норщш сыворотки используют новую порцию крахмального геля,
Активность тликогенфосфорилазы в элюате определяют, как описано в примере 2, но вместо 1 мл трис-аце- татного буферного раствора и 0,05 мл раствора фермента используют 0,5 мл элюата с колонки и 0,5 мл трис-аце- татного раствора, рН 7,0, Использованная четырехфермЕнтная- соиммобили- зованная система г1риготовлеяа, кик указано в примере 1о Расчет активности гликогенфосфорилазы в НЕ проводят так же, как в примере 6, за исключением того,- что объем сыворотки 0,5 мл.
Формула иэобретения|20
1497218 8
ЗУ, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, оксидоредуктазу и бактериальную лю- циферазу, с последующей оценкой результатов биолюминесценцией, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности определе- 1ШЯ гликогенфосфорилазы, сокращения времени анализа, расширения диапазона измеряемых активностей и упрощения процесса, используют ферменты, соиммобилизованные на BrCN-агарозе при рН 7,5-8,0, при содержании фос- фоглюкомутазы 20-200 Е/мп, глюкозо- -6-фосфатдегидрогеназы 10-100 Е/мл, НАДН : ФМН-оксидоредуктазы 2-20 Е/ /мл и бактериальной люциферазы 20 - 200 Е/мп, определение ведут путем последовательного добавления к ана- лизиpyeмo ry образцу гликогена суспензии соиммобилизованных ферментов и их субстратов и затем неорганического фосфата,а результат оценивают по начальной скорости реакции, катализируемой глИкогенфосфори- лазой,
15
5
Anal | |||
Biochem, 1981, 110, № 1, p.43-48 | |||
Arch Bioch | |||
Bioph., 1983, 226, № 1, p.285-291 | |||
Meth | |||
Enzym, 1976, Vo44, p.453 - 488 | |||
Anal Biochem, 1983, 131, № 2, p.318-323 | |||
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов | 1917 |
|
SU2A1 |
Видоизменение прибора для получения стереоскопических впечатлений от двух изображений различного масштаба | 1919 |
|
SU54A1 |
Авторы
Даты
1989-07-30—Публикация
1987-08-11—Подача