Способ определения активности моноаминооксидазы Советский патент 1989 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к способам определения ферментативной активности биологических препаратов и может быть применено в медицине, биохимии и фармакологии.

Цель изобретения - упрощение, ускорение и повьшение чувствительности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

В люминометрическую кювету вносят 0,5 мл водной смеси следующего состава: калий фосфорнокислый однозамещен- ный 34-62 мм, капяй фосфорнокислый двузамещенный трехводный 38-66 мм, рН 7,0-7,5, флавинмононуклеотид (ФМН) 10-40 мкМ, никотинамидадениндинуклео- тид восстановленный (НАДН) 0,4-1 мМ,

децштамин 3-50 мкМ, после чего в кювету добавляют бактериальную люцифе- разу до конечной концентрации 10- 100 мкг/мл. и препарат моноаминоокси- дазы (МАО). Затем за 10-60 с регистрируют скорость нарастания биолюминесценции, по которой судят об активности анализируемого препарата МАО. Измерения проводят на люминометре при . Скорость выражают в усл.ед/с. Предварительно в идентичных условиях строят калибровочную зависимость скорости нарастания биолюминесценции от количества в пробе стандартного препарата МАО с известной активностью, измеренной независимым способом, которую используют для выражения активности анализируемого препарата МАО в

сл

ю

Од

fe

абсолютных единицах (наномоль субстрата в минуту на мг белка).

-Пример 1. В измерительную кювету люмшюметра вносят 0,5 мл водной смеси следующего состава: калий фосфорнокислый однозвмещенный 62 мМ, калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 38 мМ, рН 7,0 ФМН 10 мкМ, НЛЛН 0,4 мМ, дециламин 5 мкМ, добав- ляют бактериальную люциферазу в концентрации 10 мкг/мл и анализируемый препарат митохондрий из мозга крысы в концентрации 100 мкг/мл. Помещают кювету в люминометр и при 25 С изме- ряют скорость нарастания биолюминесценции за 10 с, которая составляет 0,31 усл. ед./с. Определенное по калибровочной зависимости значение активности следует умножить на 10 (ко- эф(1)ициент, учитывающий в 10 раз меньшее по сравнению с калибровочной прямой количество люциферазы, взятое для проведения анализа), что дает мо- ноаминооксидазную активность анализируемого препарата митохондрий 10 нмоль/мин на мг белка.

Пример 2. В измерительную кювету люминометра вносят 0,5 мл водной смеси следующего состава: калий фосфорнокислый однозамещенный 34 мМ, калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 66 мМ, рН 7,5, ФМН 40 мкМ, НАДН 1 мМ, дециламин 50 мкМ, добавляют бактериальную люциферазу 100 мкг/м и анализируемый препарат тромбоцитов из крови человека в концентрации 100 мкг/мл. Помещают кювету в люмино- метр и при измеряют скорость нарастания биолюминесценции за 60 с, ко торая составляет 0,27 усл.ед./с. По калибровочной зависимости, полученной со стандартным препаратом МАО, определяют моноаминооксидазную активность тромбоцитов из крови человека, которая составляет 0,8 нмоль/мин на мг белка.

П р и м е р 3. Все операции выполняют аналогично примеру 7, однако используют водную среду измерения следующего состава: калий фосфорнокислый однозамещенный 45 Ш, калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 55 M рН 7,2, ФМН 10 мкМ, НАДИ 1 мМ, децила- МИН 20 мкМ, и в измерительную кюэе- ту вносят бактериальную люциферазу в конечной концентрации 100 мкг/мл и анализируемый препарат митохондрий из, iMosra крысы в концентрации

Q с 5

0 5

0

0

5

10 мкг/мл. , Измеренная скорость нарастания биолюминесценции составляет О,,31 усл.ед./с, что соответствует мо- нооксидазной активности 10 нмоль/мин на мг белка.

П р и м е р 4. Все операции проводят аналогично примеру 1, но- используют водную среду измерения следующего состава: калий фосфорнокислый однозамещенный 62 мН, Калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 38 htfi, рН 7,0, ФМН 1 мкМ, НАНД 0,04 мМ, дециламин О, 5 мкМ. В кювету добавляют бактериальную люциферазу в конечной концентрации 100 мкг/мл и анализируемый препарат митохондрий из мозга крысы в концентрации 100 мкг/мл. Нарастания биолюминесценции наблюдать не удается. Таким образом, выход за диапазон оптимальных концентраций компонентов реакционной смеси в сторону уменьше- :( ния делает невозможным определение активности МАО.

П р и м е р 5. Все.операции проводят аналогично примеру 2, но используют концентрации децила 1ина 400 мкМ, калий-фосфатный буфер 0,1 М, рН 8,0. Концентрации остальных компонентов . оставлены без изменения. Нарастания биолюминесценции не наблюдают.

Таким образом, выход за диапазон оптимальных концентраций реагентов в сторону увеличения делает невозможным определение моноаминооксидазной активности. . Формула изобретения

Способ определения активности мо- ноаминооксидазы путем добавления ферментного препарата моноаминооксидазы в водную буферную реакционную смесь, содержащую субстраты данного фермента, вспомогательный фермент, вызывающий хемилюминесценцию при взаимодействии с продуктами моноаминооксидазной реакции, и субстраты вспомогательного фермента с последующей оценкой актив- ности моноаминооксидазы по скорости нарастания хемилюминесценции о т ,- личающййся тем, что, с целью упрощения, ускорения и повыщения чувствительности способа, используют вод ную реакционную смесь, содержащую 0,1 М калий фосфатный буфер рН 7,0- 7,5, флавинмононуклеотид 10-40 мкМ, никотинамидадениндинуклеотид восстановленный 0,4-1,0 мМ, дециламин 3-50 мкМ и бактериальную люциферазу 10-100 мкг/мл.

Изобретение относится к способам определения ферментативной активности биологических препаратов и может быть применено в медицине, биохимии и фармакологии. Целью изобретения является упрощение, ускорение и повышение чувствительности способа. Способ осуществляют следующим образом. К водной среде измерения, содержащей субстрат моноаминооксидазы (МАО), дециламин, а также бактериальную люциферазу и ее субстраты, добавляют анализируемый препарат МАО и на люминометре измеряют биолюминесценцию, по уровню нарастания которой судят об активности МАО. Способ позволяет измерять ферментативную активность до 40 пмоль субстрата в 1 мин в пробе.