Способ определения микроциркуляции в печени Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 A61B10/00 

Изобретение относится к медицине и касается гистостереометрического исследоцаиия тканей органов. Известен способ онределения микроциркуляции в печени путем проведения строго онределершого подсчета количества точек, расноложенных на сетке светового микроскопа на одинаковом расстояни-и друг от друга, находящихся на нараллельных прямых линиях, совпавншх с тем или иным элеме 1том гистоструктуры печени в произ-. вольно выбранных участках гистологаческого среза, и подсчета процентного соот;Нои1ения дольковой паренхимы, воротных гфостранств и центральных вен J1. : Наиболее близким к предлагаемому является способ определения микроциркуля1),ии в яечени, включающий измерение ге.патоцитов на гистологическом препарате с окулярной сетки микроскопа 2. Однако известные способы не обеспечивают необходимой точности получаемых результатов, так как не учитывают особенностей микрофункционального строениут периферических и центральных отделов печеночной дольки, в частности радиального расположения балок гепатоцитов и синусоидов по отношению к центральной вене, взаимного положения печеночной артерии и воротной вены с желчным и лимфатическим капиллярами, микроциркуляции в доль ке. Цель изобретения - повышение точности способа. Поставленная цель достигается тем, Что согласно способу определения .микроциркуляции в печени, включающему измерение гепатоцитов на гистологическом препарате с помощью окулярной сетки микроскопа, центр окулярной сетки совмещают с центром печеночной дольки и измерение проводят в периферических и центральных отделах долек, гтри этом определяют объемы цитоплазмы и ядер гепатоцидов, синусов и центральной вены и при уменьшении объема цитоплазмы и ядер гепацитов и увеличении объема синусов и центральной йены по отношению к контролю определяют нарушение микроциркуляции. На фиг. изображена окулярная секторально-круговая сетка для осуществления предлагаемого способа; на фиг. 2 - таблица для результатов количественного подсчета точек. Окулярная секторально-круговая сетка представляет собой круг, разделенный на шесть равных пэ площади секторов. А, Б, В, Г. Д, Е. Каждый сектор содержит 55 точек, расположенных на 10 окружностях, причем расстояние между двумя ближайшкмн точками каждой окружности равно расстоянию между соседними окружностями, Ближайшая к центру О сртки окружность имеет 6 точек, вторая от центра окружность - 12 точек и так до 60 точек на внешней И)-й окружности, т. е. каждая внешняя окружность имеет на 6 точек больше, чем соседняя внутренняя. Каждая внешняя окружность ...любого из секторов имеет на 1 точку больше, чем с.}се;тняя внутренняя. -В изображенной на фиг. 2 таб, буква А в .левой 1рафе обозначает часть таб.ЛИ1.1.Ы; 3 которую построчно заносят результаты количественного г сдсчета точек, совпавших с триадой (Т), цитоплазмой (П.), ядром (Я) печеьочной клетки и симусбидамА (С) в секторах А, Б, В, Г, Д, Е, а цифры в графах i---0 обозначают порядковый номер периферического отдела печеночной , в котором проводят подсчет. Буквы А, Б, В, Г, Д, Е в вер-хией строке обозначают сектора сетки. Буква Б в левой графе обозначает часть табо-ишы, в которую заносят результаты количестве1;ного подсчета в ие ггральком отделе печеночной доль кн. В графу ЦВ заносят количество точек, совпавших с Аентральной веной. Остальные обозначения в этой части таблицы аналогичны обозначениям в части А. Результаты вариационно-статистическойобработки количества точек, coBnaBUJHx с тем или иным структурны ГУ элеме.чтом ткани печени, в каждом из секторов заносят построчно в часть В таблицы, а М. б, ± обозначают построчно результаты статообработки части А таблицы, М ,бэ± Ма ,р2 - результаты статобработки части Б таб.-1ииы. В часть Г построчно заносят количества точек, совпавших с триадами и всем портальны.м пространство.м (С), центральными венами (С, цилоплазмой (Gtt), ядрами (Cfl) печеночных клеток и синусоидами (Се) с каждом из 20 случаев. Результаты вариационно-статической обработки данных -части Г таблицы заносят построчно в часть Д таблицы (Ms, б, ±М Ц} для периферических и М, 62 - М, Р дЛя центральных отделов печеночной доль ки). :об осуществляют следующим обра ГЮ30 М. При подсчете гистоструктур перкфери-, ческой зоны центр сетки совмещают с центром триады с обязат-г ГьныЕ ншюжекием секторов сетки по от.ноп.1екию к печеночной артерии, воротной веке я желчному протоку и заносят данные количественного подсчета в определен:ну о часть таблицы. При гистометрии в центральной долькк центр сетки совмещают с .центрог.г центральной с определенным распаюжением секторов сетки по отношению к бли.жайшей триаде. Затей. производят подсче-: н заносят количест венные ..aaKHue центральной зоны дольки в таблицу со специальными графиками и строками, что позволяет не кглько проводить вариационно-стзтистическуО обработку KIMH4ествен.аых данный каждого сектора .зон додек и soK в целом, но к опг..гёделкть морфофункцнональмое состояние и анизотропию паренхимы органа при патологических процессах. Вычерчивание круговых хяиаграмм зон долек и плоГцадей для каждой гистроструктуры позволяет визуально определять и сравнивать выраженность патологического изменения в морфологически отличающихся, но функционально единых зонах печеночной дольки. Пример. Гистостереометрия печени собак в норме. После прелидикации морфином, вводной наркотизации гексеналом и срединной лапаротомии пpoвoд fг краевую клиновидную резекцию левой боковой доли печени у 7 со.бак. Фиксацию, об.евоЖивание, заливку в парафин, приготовление гистологических срезов толщиной 10 мкм, депарафинирование срезов, окраску гематоксилин-эозином и заключение срезов в полистирол проводят по известным тиетодикам. Изготавливают позитив окулярной секторально-круговой сетки- диаметром 20 мм так, чтобы сетка находилась в центре круга, и помещают .сетку в окуляр биноку лярной насадки микроскопа на держатель, имеющий внутреннее отверстие больще, чем диаметр сетки. С помоплью объект-микрометра определяют диаметр и радиус сетки по 11-й окружности при-увеличении 80, 200, 400, После этого вычерчивают 7 таблиц для занесения .тистометрических данных каждого эксперимента. Для получения заготовок диаграмм на двух листах вычерчивают-сетку без точек, а из самой сетки вырезают шаблон по внешнему краю 11-й окружности, оставляя на шаблоне буквы, обоз начающие сектора. Гистостереометрию в каждом из 7 случа-..ев проводят следующим образом. Помещают на предметный столик микроскопа предметное стекло с гистологическим срезом и при малом (окуляр. Ю , объектив 8), а потом при большом (окуляр 10, объектив 40) увеличении микроскопа находят триады (печеночную артер.иолу, воротную венулу, желчный капилляр), расположенные на расстоянии 100-300 мкм от капсулы печени, и проводят количественный подсчет синусоидов, цитоплазмы и ядер печеночных клеток в тех отделах периферии долек, где общее количество точек, совпавших со структурными элементами портального пространства не превышает 33, т. е. 10% от общего числа точек сетки. При йтом сетку располагают так, что ее центр совпадает с центром триады и в секторе А сетки находится печеночная артериола. Посекторальный подсчет и внесение в часть А таблицы количества точек, совпавших с портальным пространством, цитоплазмой и ядрами печеночных клеток и синусоидами, начинают с сектора А, и при расположении желчного капилляра справа от артериолы подсчет гистоструктур в остальнЫх секторах ведут по ходу вращения часовой стрелки, а при расположении капилляра слона от артсриояы --- наоборот. При гистометрии в центральных отделах долек, удаленных от капсу.пы печени на 100-зоб мкм, центр сетки совмещают с центром центральной пены и сектор А обязательно направляют и сторону ближайшей триады, а посекторальный подсчет точек, совпавщих с центральной веной, цитоплазмой, ядрами печеночных клеток и синусоидами, начинают с сектора А и потом проводят в секторах Б, В, Г, Д, Е, а количественные данные заносят в часть Б таблицы.. Суммарное количество точек, совпавших в каждом из 20 участков с триадами (Gr). центральными венами (Сць), цитоплазмой генатоцитов (Си), ядрами гепатоцитов (Си) и синусоидами (Ср), заносят в часть Г таблицы. Результаты вариационно-статистпческой обработки количества точек, совпавших со структурными элементами в секторах периферических отделов долек в каждом изТэкспериментовТ за иосят в вер. половину части В таблицы, а результаты статообработки гистометрических данных в секторах центральных отделов долек вносят в нижнюю половину части В таблицы. В верхнюю половину части Д таблицы вносят результаты вариационно-статистической обработки гистометрических данных периферических отделов долек, а в нижнюю половину - центральных. После вариационно-статистической обработки гистометрических даннух 7 экспериментов получают следующие результаты. Из 33 (330 в секторах и 1 в центре) точки (100°/о) в периферическом отделе дольки с триадами совпадает 21 точка (6,3%), е цитоплазмой печеночных - 199 точек (60,20/о), с ядрами печеночных клеток - 47 (14,) с синусоидами - 64 точки (19,3%), а ядерноплазменный коэффициент составляет 0,236. Из 331 точки (100%) в центральном отделе дольки с центральной веной совпадает 8 точек (2,4%), с цитоплазмой печеночных клеток - 207 точек (62,5%), с ядрами печеночных клеток - 45 точек (13,6%), с синусоидами - 71.точка (21,5%), а ядерноплазменный коэффициент составляет 0,217,. Из общего количества точек 662 в периферическом и центральном отделах дольки с цитоплазмой печеночных клеток совпадает 406 точек (61,3%), с ядрами печеночных клеток - 92 точки (13,9%), с синусоидами - 135 точек (20,4%), с портальным пространством и центральными венами - 29 точек (4,4%), а общий ядерноплазменный коэффициент составляет 0,227. Путем деления ядерно-плазменного коэф(фициента периферического отдела печеночной дольки (0,236) на ядерно-плазменный коэффициент центрального отдела дольки (0,217) и умножения частотного на 100% устанавливают, что интенсивность обменных

ripoiuHcon в печеночных к.четкях на периферии лол|,кп в норме у собак n;i 8,7()% , чем в печеночных-клетка.х дольки, расгк)ложеш1р 1х BOKfjyr цеитраьпьны.х вен. После этого 11рои: в()лят подсчет, процеитносо соотношения гистоструктур, ядерно-плазменного коэффициента и соотношение интенсивности обменных процессов в печеночных клетках в каждом секторе как периферии, так и центра печеночной дольки. При этом получают следуюпще результаты.

Процентное соотношение портального пространства, цитоплазмы, ядер печеночных клеток и синусоидов в секторе А периферического отдела дольки составляет соответственно перечисленным гистоструктурам 9,1 W/0, 60,0%, Г2,7/о; 18,2о/о; в секторе В 5,5«/о, 61,8%; 14,5%; 18,2% в секторе В 5,5%, 58,2%, 14,5%; 21,8% в секторе Г 5,5%; 60,0%; 14,5%; 20,0% в секторе Д 5,5%; 61,8%; 14,5%; 18,2%.

Ядерно-плазменный коэффициент составляет в секторе А 0,212, в секторе Б 0,235, в секторе В 0,250, в секторе Г 0,242, в секторе Д 0,242, в секторе Е 0,2.55.

Процентное соотношение центральной ены, цитоплазмы и ядер печеночных клеток, синусоидов в секторе А центрального отдела дольки составляет соответственно перечисленным гистоструктурам 3,7%; 61,8%: 12,7%; 21,8%; в секторе Б 1,8%; 61,8%; 14,6%; 21,8%; в секторе В 1,8%; 65,5%, 12,7%, 20,0% в секторе Г 1,8%,63,7% 12,7%, 21,8%; в секторе Д 1,8%, 6-1,8%, : 14,6%, 21,8%; в секторе Е 1,8%; 61,8%, 14,6%, 21,8%.

Ядерно-плазменный коэффициент составляет в секторе А 0,206, в секторе Б 0,235, в секторе В 0,194, в секторе Г 0,2, в секторде Д 0,235 и в секторе Е 0,235.

Интенсивность обменных процессов в печеночных клетках периферического отде,ла дольки большее в секторе А на 2,91%, Б секторе Б на 0%, в секторе В на 24,74%, в секторе Г на 21,0%, в секторе Д на 2,98% и в секторе Е на 8,51%, чем в печеночных клетках центрального отдела дольки.

После этого приступают к определению объема гистоструктур в кубических микронах {мкм). Для этого помещают объектмикрометр на предметный столик микроскопа и при увеличении окуляра 10 и объектива 40 определяют диаметр вставленной в окуляр сетки по 11-й окружности и радиус ее в мкм. Согласно полученным данным радиус сетки составляет 95 мкм. После, этого определяют площадь, которую охватывает сетка при данном увеличении, что составляет 28353 мкм. Площадь одной точки определяют делением площади сетки на количество точек (331), что составляет 85,7 мкм, а объем 1-й точки получают умножением ее площади на толщину среза (10 мкм), что составляет 857 мкм.

Круговые диаграммы гистоструктур вычерчиваютследующим образом: на 1-й лист

с вычерченно й окулярной сеткой наклады.вают шаблон так, 4To6i,i границы 11-й окружности и ceKTOpoEi coBna.iH с гра: 1ицами вычерченной окулярной сетки на листе бумаги, затем-СКВОЗЬ точки на шаб/юнц иглой прокалывают 5 точек, совпавпшх в секторе А с триадой (точку первой окружности, обе точки второй окружности, ближнюю к левой границе сектора точку третьей окружности- и вторую от левой границы сектора точку), 10 точек, совпадаюших с синусоидами (последнюю точку третьей окружности, четыре точки четвертой и пять точек пятой окружности), 7 точек, совпадающих с ядрами печеночных клеток (начиная с ближней к левой границе сектора до седьмой на 11-й окружности), а остальные 33 точки, соответствующие цитоплазме, не прокалывают. По такому же принципу делают проколы точек в других секторах этой диграммы и второй (для центрального отдела дольки). После этого, убрав шаблон, приступают к выверчиванию границ между площадями гистоструктур при помощи циркуля с рейсфедером. Для вычерчивания . границы между площадью портального пространства и площадью синусоидов циркульную ножку с иглой ставят в центр О диаграммы, а ножку с рейсфедором отводят на середину расстояния между 3-й и 4-й окружностями (для очерчивания левой пограничной дуги) и от радиуса АО вправо очерчивают дугу длиной 1,5 а (а - расстояние между точками сектора). Затем сводят ножки циркуля так, чтобы рейсфедор нахо.цился на середине расстояния между 2-й и 3-й окружно.стями (для очерчивания правой пограничной дуги) и от радиуса ВО вправо-очерчивают дуг.у длиной а/2. После этого сводят ножки циркуля на расстояние а/2 и, поставив ножку с иглой на вторую точку 3-й окружности (для очерчивания межпограничной дуги), соединяют концы правой и левой пограничных дуг дугой раДиуса а/2.

Для вьгчерчивания границы feждy площадью синусоидов и площадью цитоплазмы ножку циркуля с иглой ставят в точку О и отведенной на середину расстояния между 5-й и 6-й окружностями ножей с рейсФедором от радиуса АО до радиуса ВО очерчивают пограничную дугу.

Для вычерчивания границы между площадью цитоплазмы и ядер циркульную ножку с иглой ставят в центр О, а Ножку с рейсфедором отводят на середину расстояf ия между 10-й и окружностями и от радиуса АО прочерчивают дугу дли:чой 6,5 а по направлению к радиусу ВО, затем соединяют конец этой дуги с П-й окружностью дугой радиуса а/2.

Границы между площадями центральной вены, синусоидов, цитоплазмы и ядер печеночных клеток вычерчивают следующим образом. Для вычерчивания границы

между iT.ioiiU.U.K) исчпральиой вены и сиПУСОИДОП 1 11рКу.1|)ИуК) КОЖКу с И1.-1ОН ПЛВЯТ

в центр О, тЧ ножку с рей{;(|)елором отводят на расстояние а и от ралиуса iiO но н чправленню радиуса Л() прочерчивают лугу длиной а/2. Потом, свеля ножки циркуля на расстояние а/2 и нолстапив ножку циркуля с иглой на первую (слева) точку 2-й окружности, ножкой с рейсфелером от кон.ца нрочерченой правой межокружностной дуги ло ралиуса АО .прочерчивают оставшуюся часть границы.

Для вычерчивания границы межлу площадью сииусоилов и площадью цитоплазмы печеночных клеток накладывают шаб-. лон, вырезанный из окулярной сетки, на 2-ю диаграм.му, совм.естив грани 1ы секторов и 11-й окружности шаблона с аналогичными границами диаграммы, и через точки на шаблоне прокалывают |2. точек, соответствующий синусоидам (оставшуюся точку 2-й окруж.ности, все точки 3-й и 4-й окружностей и 4 точки 5-й .ок-ружности от радиуса АО к радиусу БО). После этого н.ожку циркуля с иглой ставят в центр диаграммы и отведенной на середину расстояния между, 5-й и 6-й окружностями циркульной ножкой с рейсфедером от. ралиуса АО по направлению к ралиусу БО прочерчивают дугу.-длиной 3,5 а. Далее сводят ножку с рейсфедором на середину расстояния ме.жду 4-й и 5-й окружгюстями и от радиуса БО влево .прочерчивают дугу длиной а/2 и, сведя ножки циркуля -на расстояние а/2, ставят ножку с иглрй на 4-ю (слева) точку 5-й окружности и соединяют правую и левую дуги дугой радиусом а/2.

. Для вычерчивания границы между площадями цитоплазмы и ядер печеночных клеток ножку циркуля с иглой .стравят в центр диаграммы и отведенной на середину расстояния между 10-й и 1}-й окружностями ножкой циркуля с рейсфедором от радиуса АО вправо прочерчивают дугу длиной 6,5 а, затем в 7-ю точку 11-й окружности от радиуса АО по направлению к радиусу БО) ставят циркульную ножку с иглой и от правого конца дуги между 10-й и 11-й окружностями очерчивают дугу радиусом а/2 до 11-й окружности. По такому же принципу вычерчивают границы площадей гистроструктур в остальных секторах диаграммы с последующей условной штриховкой площади каждой гистроструктуры.

Буквенное обозначение секторов, расположение точек на 10 окружностях и наличие специальных частей в таблице для количественных гистометрических данных позволяют проводить не только подсчет количества гистоструктур в секторах и на радиусах R, Rj, Rg, ...Rttt, но и определять координаты любой точки при более детальном (гистотопографическом) исследовании гистоструктур. При. необход.имости гисто onoгpaфl чeгкoгo исследования таблицу тфи.меияют .ч,1и составления гистотопосраммы 1-го 1:орифорич1Ч-кого и 1-го центральною оглело печеночной лольки. В этом случае ui(f) 1 10 в графах частей А и Б таблицы со(твотствуют порялковому .(изнутри кнаружи) но.мсру окружности, а порядковый подсчет точек по окружностям в кажлом секторе необходимо вести слева направо.

Пусть 4-я (от ралиуса БО по направлению к ралиусу ВО сектора Б) точка 7-й окружности совпадает с ядром печеночной. клетки на периферии дольки. Тогда ее координаты Б7-4Я (Б - буква, .обозначаю: щая сектор; 7 - порялко,вый от центра сетки номер окружности; 4 - порядковый от ралиуса БО вправо номер точки; Я - ядро печеночной клети) и в графе с буковой Я сектора Б на 7-й строке части А таблицы ставят знак +.

При п.роведении вариационно-статистической обработки гистометрических данных печеночной дольки у собак в норме и перевода статистических данных из тестточек в кубические микроны получают следующие результаты (в тысячах мкм).

Обьем гриад составляет 1,0±0,34 (р 0,05). цитоплазмы печеночных клеток 172,86±0,77 (,01), ядер печеночных кле-ток 38,74 ±0,47 (.05) и синусоидов 54,25±0,54 (,01).. -

В центрально.м отлеле печеночной дольки объем центральной вены составляет 6,94 ± 0.11 (,05).-цитоплаз.мы печеночных клеток 176,46 ±0.58 (,01), ядер печеночных клеток 38,91 ±0,25 (,01 и синусоидов 60,5±0,39 ,01).

Общий объем лольковой цитоплазмы печеночных клеток при этом равен 407,57± 1,58 (,01) ядер, печеночных клеток 91,86± ±0,98) (,05), синусоидов 193,86 ±0,5 (,01) и триал с центральными венами 30,14 ±0,48 (,05).

Посекторальные объемы триады, цитоплазмы, ядер печеночных кл«ток и синусоидов в периферическом отделе дольки составляет в секторе А соответственно 4,2 ±0,09 (,05), 27,34±0,13 (,01), 6,26±0,13 (,05), 0,43±0,09 (,01) в секторе Б 2,66.±0,11 (,05), 29,65±0,15 (,01), 5,91 ±0.09 (,05), 8,83±0,07 .01); в секторе В 2,83±0,04 (,05), 28,88. 0,13 (,02), 6,34 ±0,07 (р 0,01), 9,08 ±0,11 (,1)5); в секторе Г 2,66 ±0,04 (,05), 28,81 ±0,2 (р;0,0-|), 6,86±0,09 (,05), 8,83±0,07 (р 0,01); в секторе Д 2,49±0,04 (,05), 29,22±0,11) (,01, 6,77±0,11. (fKO,05), 9,34±0,07 (,01); в секторе Е 2,74±0,04 (,05), 28,02±0,15 (,01), 6,94±0,11 (рч:0,05), 8,83±0,11 (,05)..

Посекторальные объемы центральной вены, цитоплазмы, ядер печеночных клеток, синусоидов в центральном отделе дольки

мстявляют cooTBt TCTBpHHo п секторе Л 1,41г±0,44 (,П5), 28.8 ±0,11 (),01), 6,26±0,13 (,05), 9,43±0,04 (,0); в секторе Б ,2±0,03 (,05), 29,91 ±0,1 1 (р.0,01), 5,91 ±0,09 (р.0,05), 10,28±0,07 (,01); в секторе В 1J 1 ±0.03 ,05), 29,74±0,13 (,01), 6,5 ±0,09) (,05),

9,77 ±0,1 (р-:.0,05); в секторе Г i,11 ±0,03

(,05), 29,74 ±0,1 (,0), 5.0±0,07 (рсО,0), 9.94±,0,i (р.0,01}; в секторе Д 0,86 ±0,03 (,05), 29,14±0,09 (,09), 6,94 ±0,09 (piO.OS), iO,28±0,09 (,0t); в секторе Е 1,37 ±0,04 (,05), 29.05±0,16 (,01), 6,86±0,11 (,05), 9,,04 ,01).

Преллзгаемый способ обеспечивает высоку) точность, последовательность подсчета, возможность создания алгоритмов и

10

программ длн матемятигргкого Mi;rr;ii|iiiвання и ана.1иза патоморфо.югичсских процессов и юзво.пяет определить ис тилькс обише нарушения MHi.pnuHiiKv.inuni в печени, но и (функциональиыс измеие1(ия з дол.ьковой паренхиме (ядерно-плазмелпый к 1эффициент). Проведение не только общего исследования .нарушения крЪвообрап г-ния и функционального состоуи1ия дольковой iiaренхимы. но и исследования с периферических и центральных отделах дает возможность определять морфофункциональны.е нарушения в каждом из этих отделов. Каждый сектор как периферического, так и центрального отдела печеночной дольки является- С1 руктурной единицей, характеризующейся определенным морфофунхциональным состоянием в nopivie и по ргзному реагирующей на нарушения кровообращения.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКрециркуляции В ПЕЧЕНИ, включаю-, щий измерение гепатоцитов на гистологи ческом- препарате с помощью окулярной сетки, микроскопа, отличающийся тем, что, с целью ювышения точности, центр окулярной сетки совмещают с центром печеночной дольки и и-змерение проводят в перифернчески.х и центральных отделах долек, при этомопределяют объемы цитоплазмы и ядер гепатоцитов, синусов и центральной вены и при уменьшении объема цитоплазмы и ядер гепатоц41тов и увеличении объема синусов и центральной вены по отношению к контролю определяют нарушение микроциркуляции. W 4 сд о О5