Способ определения активности лизосомальных ферментов Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 

D1

00

ч,

э

Изобретение относится к фармако- логии и южeт быть использовано в биохиьши, био({мзике и онкологии при определении ферментативной активности ферментов, локализованных в s лизосом. .. .

Известен способ определения ферментативной активности мембранных ферментов ;путем обработки мембранной фракгщи детергентами, поверхностно- to активными веществами to .

Однако поверхностно-активные вещества существенно нарушают нативные Свойства изучаемых ферментов, а также затрудняют определение фермента- fs тивной активности.

Известен способ определения ферментативной активности лизосомольных ферментов путем лабилизации мембран лизосом витамином А 2. 20

Однако данное соединение вызывает лишь незначительную лабилизацию мембраны, причем Активные концентрации лабилизатора должны значительно превышать концентрации измеряемых 25 ферментов.

Необходимость высоких концентраций лабилизатора снижает чувствительность известного способа.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа.

. Указанная цель достигается тем, что согласно способу определение активности Лизосомальных ферментов путем лабилизации мембран лЯа(ос(м с последуняцим определением фермен- 3i тативной активности, в качестве ла- билизатора используют углеводород антраценового ряда, выбранный из группы: 2-бензпирен; Э,4-бензпирен; 9,10-диметил-Т,2-бензатрацен; 40 антрацен в концентрации 20-200 мкг на 1.00 мкг белка лизосом. i

Способ осуществляют следующим

образом.

К суспензии лизосом, вьщеленных из печени крыс (| мп суспензии лизо-: сом в 0,25 м сахароза) добавляется О,1 мл .полициклняеСкого углеводорода, раствЪренного в этиловом спирг те (конечная концентрация от 20 до ; 50 200 4Кг на 100 мкг белка лизосом). i Смесь инкубируется при комнатной

температуре 30 мин. Затем в сус пензии лизосом определяют активность,

Кислой фосфотазы.

Для этого к 1,5 мл субстрата- гглицерофосфата,- рН 4,9 приливают 0,5 мл I мл сахарозы и помещают, на 15 мин в водяную баню при , после чего добавляют 0,2 мл гомогената и инкубируют ГО мин на водяной бане. Затем инкубационную смесь охлаждают и реакцию останавливают добавлением 2 мл холодной 10%-ной трихлоруксусной кислоты, смесь центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. К 2 мл надосадочной жидкости добавляют 0,5 МП молибдата аммония и 1 мл 1% аскорбиновой кислоты. Через 5 мин определяют оптическую плотность на ФЭК-е при длине волны 635 нм.

, По увеличению активности кислой фосфотазы судят о степени лабилизации мембраны.

Пример. Лизосомы печени крыс инкубируют с 1,2-бенэопиренрм и с известным лабилизатором витамином А. В каждой отдельной пробе концентрации 1,2-бензопирейа составляла 20, 100, 200, 300, 400, 500,

550 мгк/100 мкг белка лизосом, а концентрация витамина А - 100, 200, 300, 400, 500 и 600 мкг/ 100 мкг белка лизосом. Условия инкубации и определение активности кислой фосфатазь (степени лабилизации мембраны приведены выше).

Результаты типичшлх измерений представлены в табл. I.

Пример 2. Лиз(осомы печени крыс :инкубируют с I,2-бензпиреном, 3,4-бензапиреном, 9,10-диметил-1,2бензантраценом, антраценом и витамином А в концентрации 150 мкг лабилизирующего агента на 100 мкг белка. . ;.. ;

Результаты приведены в табл. 2 (условия инкубации и -измерения аналогичны примеру 1).

Полициклическйе углеводороды антраценового ряда вызывают лабилизацию мембран лизосом в 2-3 раза более интенсивную чем известные природные лабилизаторы и могут быТь использованы в самых разнообразных биохимических и медицинских экспериментах, связанных с лвбилизацией биомембрак для определения активности лизосомальных ферментов.

Таблица J

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛИЗОСОМАЛЬНЪК ФЕРМЕНТОВ путем лабилизации мембран лизосом с последующим определением ферментативной актйвйости,о т л и ч а ю щ и и тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве лабилизатора используют углеводород антраценового ряда, выбранный из группы: 1,2-бензпирен; 3,4-бензпирен; 9,10г . диметил ,2-бензатрацен; антрацен . в концентрации 20-200 мкг на 100 мкг белка лпзйс.ом. . .

Вещество

Исходные мембраны Витамин А 1,2-Бензпирен 3,4-Бенэпирен

9,10-Диметил-1,2-бен9антрацен

Антрацен

Т а б А и ц а 2

Активность фермента (фосфор в мкмоль/мин/мг белка)

0,024 0,031 0,054 0,072

0,092 0,086