Способ определения кислой фосфотазы из печени животных Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биохимии и касается исследований в энзимоло- гии.

Целью изобретения является повышение чувствительности и точности способа.

Способ осуществляется следуняцим образом.

Ферментный препарат (0,1-7,2 мг белка) инкубируют в присутствии суб- страта (27,7-24,4 мкмоль на 1,7- 1,5 мл конечного объема) в 0,1 М ацетатном буфере рН 5, приготовленном на 0,7 М растворе сахарозы.Инкубацию проб при прекращают через 30 мин добавлением 0,5 млО,2М .НСЮ . В 0,9 МП супернатанта, полученного при центрифугировании проб при 5000 об/мин, определяют Р, .

Пробы содержат 100 мг аскорбиновой кислоты и 25 мг молибдата аммония 4HjO, приготовленного на 1 н, серной кислоте, на 3 мл конечного объема. Инкубирование при 45°С заканчивают через 20 мин, охлаждают и измеряют величину оптической плотности пробы против контроля на реактивы и растворители при 820 нм на спектрофотометре. Абсолютное количество фосфата в пробе определяют по калибровочному графику и считают его эквивалентным количеству гидролизованного субстрата. За единицу ферментативной активности принимают 1 катал.Удельную активность кислой фосфатазы выражают количеством нанокаталов, отнесенным к 1 кг белка. Белок определяют методом Лоури.

Пример. В работе используют

fO

15

бавляя в среду для инкубации тритон JC-100 до конечной концентрации 0,1- 0,2, определяют общую активность фермента. Доступную форму активного этого фермента определяют аналогичным образом но без добавления в ср ду инкубации детергента. В суперна- танте этой фракции измеряют в,еличин активности свободной (неседементиру мой) формы зтой гидролазы. Доля активности свободной формы фермента относительно общей, выраженная в пр центах, была мерой (показателем) це лостности лизосомных мембран (ПЦЛМ) а разница между доступной -и свободной формами энзима, выраженная аналогичным образом, служит показателе степени их проницаемости - лабилиза ции (ПЛЛМ).

Активность кислой фосфотазы (КФ 3.1.3.2) определяют по приросту в пробе Р; при инкубации 0,1-0,2 мг бел ка с р -глицерофосфатом натрия (27, и 24,4 мкмоль на конечный объем в 1,7 мл для общей и 1,5 мл для досту ной и свободной форм активности фер мента) в 0,1 М ацетатном буфере рН приготовленном на 0,7 М растворе са харозы. Инкубацию проб при 37°С пре {кращают через 30 мин добавлением 0,5 мл 0,2 М HClOi. Контрольная про ба содержит те же компоненты, кроме ферментного препарата, который до- . бавляют сразу после хлорной кислоты 35 В 0,9 мл супернатанта, полученно го при центрифугировании проб пр 500 об/мин, определяют Р .

Проба содержит 100 мг аскорбиновой кислоты и 25 молибдата аммония «

20

25

интактных самцов кроликов породы Шин- 0 4Н20 приготовленного на Ш серной

шилла массой 2,5-3,5 кг. Печень берут у наркотизированных гексеналом животных., перфузируют на льду ледяным физраствором, промокают бумажными фильт- 45

рами, тщательно очищают от соедини тельной ткани и взвешивают. Гомогенат готовят из расчета 1:9 (вес ткани на объем среды для гомогенизирования). Гомогенизацию проводят в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвейема с тефлоновым пестиком (зазор 0,21 мм) в течение 30 с при 1200 об/мин. В качестве источника фермента используют обогащенную фракцию лизосом, полученную дифференциальным центрифугированием с использованием градиента сахарозы. Осадок ресуспендируют в среде для гомогенизирования и, докислоте, на 3 мл конечного объема. Инкубирование проводят при и з канчивают через 20 мин, охлаждая пр бы и измеряя величину ее оптической плотности против холостой пробы. Аб солютное содержание Р в пробе нахо дят по калибровочному графику и счи тают его эквивалентным количеству гидролизованного субстрата. Величин оптической плотности окрашенных рас воров измеряют на спектрофотометре. За единицу активности фермента принимают 1 катал., Удельную активность кислой фосфатазы выражают количест- 55 вом нанокаталов, отнесенным к 1 мг белка. Все препаративные процедуры тканью печени осуществляют при 0-4° на колоде. Белок определяют методом

50

O

5

бавляя в среду для инкубации тритон JC-100 до конечной концентрации 0,1- 0,2, определяют общую активность фермента. Доступную форму активного этого фермента определяют аналогич . ным образом но без добавления в среду инкубации детергента. В суперна- танте этой фракции измеряют в,еличину активности свободной (неседементируе- мой) формы зтой гидролазы. Доля активности свободной формы фермента относительно общей, выраженная в процентах, была мерой (показателем) целостности лизосомных мембран (ПЦЛМ), а разница между доступной -и свободной формами энзима, выраженная аналогичным образом, служит показателем степени их проницаемости - лабилиза- ции (ПЛЛМ).

Активность кислой фосфотазы (КФ 3.1.3.2) определяют по приросту в пробе Р; при инкубации 0,1-0,2 мг белка с р -глицерофосфатом натрия (27,7 и 24,4 мкмоль на конечный объем в 1,7 мл для общей и 1,5 мл для доступной и свободной форм активности фермента) в 0,1 М ацетатном буфере рН5, приготовленном на 0,7 М растворе сахарозы. Инкубацию проб при 37°С пре- {кращают через 30 мин добавлением 0,5 мл 0,2 М HClOi. Контрольная проба содержит те же компоненты, кроме ферментного препарата, который до- . бавляют сразу после хлорной кислоты. 5 В 0,9 мл супернатанта, полученного при центрифугировании проб при 500 об/мин, определяют Р .

Проба содержит 100 мг аскорбиновой кислоты и 25 молибдата аммония

0

5

0 4Н20 приготовленного на Ш серной

5

кислоте, на 3 мл конечного объема. Инкубирование проводят при и заканчивают через 20 мин, охлаждая пробы и измеряя величину ее оптической плотности против холостой пробы. Абсолютное содержание Р в пробе находят по калибровочному графику и считают его эквивалентным количеству гидролизованного субстрата. Величину оптической плотности окрашенных растворов измеряют на спектрофотометре. За единицу активности фермента принимают 1 катал., Удельную активность кислой фосфатазы выражают количест- 5 вом нанокаталов, отнесенным к 1 мг белка. Все препаративные процедуры с тканью печени осуществляют при 0-4°С на колоде. Белок определяют методом

0

31294771

Лури. Все численные результаты опытов подвергают статистической обработке. Зависимость величины оптической

т п

плотности (А ., стандартного (10 мк-М

850

раствора неорганического фосфата от соотношения концентраций аскорбиновой кислоты (С-) и молибдата аммония (С) в аналитическом реагенте представлена в табл.1.

Из табл.1 видно, что максимальная величина оптической плотности стандартного раствора фосфата становится при соотношении концентраций растворов аскор биновой кислоты и молибдата аммония 2. Дальнейшее увеличение это то соотношения не влияет на величину экстинции исследуемого раствора ввиду ограниченного растворения аскор- бинбвой кислоты в воде (33 г на 100 мл), максимальная величина этого коэффициента может быть 12, Этими значениями определяется эффективный диапазон концентраций аскорбиновой кислоты в аналитическом реагенте.

Сравнивают калибровочные зависимости для предлагаемого метода и известного тангенсы угла наклона равны 0,029 и 0,019 для указанных способов соответственно. Поскольку это соответствует коэффициентам инструментальной чувствительности (S АГс ),

.то относительная чувствительность фотометрической реакции предлагаемого метода в 1,5 раза выше известного. Величина кажущегося десятичного-молярного koэффициeнтa экстинции данной фотометрической реакции ( Е.д 30 500) также в 1,5 раза вьпие чем в известном способе (g 19 000). Калибровочные зависимости в выбранных диапазонах концентраций носят линейный характер, что позволяет использовать основной закон светопог-. лощения для вычисления величины- относительной чувствительности определения. Предлагаемый способ (Смин мкМ) в 1,5 раза чувствительнее известного (Смин 0,26 мкМ). Поскольку при большем значении коэффициента инструментальной чувствительности и кажущегося десятичного молярного коэффициента экстинк- ции погрешность определения меньше

S A,C -«- -8 7S . то точность определения активности кислой фосфатазы предлагаемым методом . выше, чем в известном способе.

5

Способ опробируют, определяя активность различных форм фермента из печени интактных животных.

Значение случайных погрешностей данного метода оценивают, рассчитывая основные метрологические характеристики d,w,S,E ,n,S, являющиеся мерой воспроизводимости, из результатов десяти параллельных определений. Значения удельной активности всех фори фермента близкие к приводимым в,литературе. Стандартное отклонение среднего результата не пре- вьшает 1%, степень рассеивания отдельных измерений около средрей низкая (менее 5%), выборка однородна.

Проводят измерение активности кислой фосфатазы в течение шестичасового периода ночного времени суток, с О ч. В течение выбранного периода времени активность исследованной гидролазы претерпевает существенные изменения. К 3 ч ночи она несколько возрастает, а к 6 ч утра значительно снижается, общая и доступная формы - в 2 раза, свободная - 1,5 раза.Аналогичным образом изменяется показатель целостности лизосомальных мембран. В изменении активности этих двух форм фермента наблюдается наибольшая синхронность. Противоположный характер носит динамика показателя лабиализации лизосомных мембран. Наименьшее значение показателя лаби- . 5 ;ализации лизосомных мембран приходит- 1ся на 3 ч ночи.

Оценка достоверности результатов 0:определения активности кислой фосфатазы из печени кролика дана в табл.2.

Уровень активности различных форм кислой фосфатазы и показатели струк- 5 турно-функционального состояния лизо- сом vi3 печени кроликов даны в табл.2.

Формула изобретения

0

5

0

50

55

Способ определения кислой фосфатазы из печени животных, включающий смешивание ферментного препарата печени с субстратом, инкубацию смеси, остановку ферментативной реакции кислотой, добавление аналитического реагента с последующим спектрофотомет- рированием, отличающийся тем, что, с целью повышения чувстви- тельности и точности способа, в каВыборочное среднее, х-10

Стандартное отклонение среднего результата, tS

Абсолютная воспроизводимость:

среднее отклонение от . среднего, d-IO

вapиaбильнocть,w10

стандартное отклонение, S-10-

Относительная воспроизводимость:

относительное среднее отклонение, EJJ

относительное стандартное

отклонение,

Примечание. Расчеты статистических показателей проводят на основании результатов десяти параллельных определений фермента из печени животного,взятой в О ч.

Таблица 2

2

0,4

1,0

4

1,3

1,6 2,1

33 0,3

0,64

2

0,9

U92,7

Примечание, Результаты на материале от пяти

животных, взятом в течение 1 сут в указанные часы.

Редактор Н, Гунько

Составитель И. Тареева

Техред Л.Олейник Корректор М. Пожо

Заказ 552/24 Тираж 777Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва,.Ж-Э5, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие; г. Ужгород, ул. Проектная,4

1294771 8

Таблица 3

Изобретение относится к биохимии и касается исследований в энзи- мологии. Целью изобретения является повышение чувствительности и точности способа. Готовят гомогенат из печени животных и вьщеляют из гомогена- та обогащенную фракцию лизосом, которую используют в качестве источника фермента. Фермент инкубируют с за- буференным р-глицерофосфатом натрия. Инкубацию проб прекращают добавлением НСЮ . В супернатанте определяют. Р . Проба содержит аскорбиновую кислоту и молибдат аммония в соотношении 2:1-12:1. Величину оптической плотности измеряют при 820 нм на спектрофотометре. Удельную активность кислой фосфатазы выражают количеством нанокаталов, отнесенным к 1 кг белка. 3 табл. (Л с tN3 CD 4