Способ хроматографического определения жирнокислотного состава липидов природных объектов Советский патент 1983 года по МПК G01N31/08 

Изобретение относится к способам количественного определения жирнокислотного состава различных групп липидов с применением методов экст .ракции и газовой хрома- ографии и мо жет быть использовано в области ис следований липидов природных объек тов. ,. Известен способ определения жир нокислотного состава липидов природ ных объектов, заключающийся в обра ботке исследуемого материала хлороформ-метанольной смесью, отделении экстракта от шрота, отгонке хлорофо ма и метанола с последующим хромато графированием метиловых эфиров ясирных кислот свободных и связанных ли пидов, полученных после обработки липидов метанолом и ацетилхлоридом. Исходный образец гомогенизируют в 10 объемах метанола или смеси хлореформ - метанол (l:l) при комнатной температуре или при 0° С.К. гомогенизату добавляют метанол или хлороформ, чтобы количество растворителя на один объем исходного материала бьшо не менее 20 объемов хлороформ:метанол 2:1. Экстракцию повторяют три раза. После этого к объединенннм, надосадочным жидкостям добавляют на l объем 0,2 объема подкисленного ОД М раствора KCf. При стоянии (10-12 ч) образуется двухфазная система. Верхний слой отбрасывают, нижний промывают, упаривают и выделенные липиды обрабатывают метанолом и ацетил хлоридом с последующим хроматографирбванием метиловых эфиров жирных кислот свободных и связанных липидов l . Недостатком этого способа являетс многостадийность, трудоемкость, кая точность и отсутствие воёможности определения жирнокислотного состава различных групп липидов, что особенно необходимо при исследовании липидного комплекса микроорганизмов, в котором связанные и прочносвязанные липиды составляют значительную часть. Наиболее близким к предложенному по Технической сущности и достигаёмому результату является спосхэб определения жирнокислотного состава липидов природных объектов/ включающий обработку исследуемого образца растворителями с различной пойярностью, отделение липидсодержащего экстракта от шрота с последующей отгонкой растворителя обработку липидов метанолом и ацетилхлоридом 2 . . Недостатком этого способа являются большие затраты времени, реактивов , многостадийность, трудоемкость. Цель изобретения - сокращение,, времени анализа. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу хроматографического определения жирнокислотного состава липидов природных объектов, включающему обработку исследуемого образца растворителями с различной полярностью, отделение липидсодержащего экстракта от шрота с последующей отгонкой растворителя, обработку липидов метанолом и ацетилхлоридом, исследуемый образец делят на три части, обработке растворите 1ем параллельно подвергают две из низ, используя в качестве растворителя при обработке первой части - диэтиловый эфир с получением метиловых эфиров жирных кислот суммы связанных и прочносвязанных липидов , второй части - хлороформметанольную смесь в соотношении 2:1 с получением метиловых эфиров жирных кислот прочносвязанных липидов, третью часть непосредственно обрабатывают ацетилхлоридом и метанолом с получением метиловых эфиров жирных кислот суммарных липидов, шроты, полученные после обработки первых двух частей, также обрабатывают ацетилхлоридом и метанолом, метиловые эфиры жирных кислот, полученные после обработки каждой части и шротов, хроматографируют отдельно, при этом содержание жирных кислот свободных липидов определяют по разности содержания жирных кислот, полученных после обработки третьей и первой частей, содержание жирных кислот связанных липидов определяют по разности содержания жирных кислот, полученных после обработки первой и второй частей исследуемого образца. На чертеже показана схема определения жирнокислотного состава различных групп липидов по предлагаемому способу. Способ осуществляют следующим образом. Исследуемый образец делят на 3 части. Для определения жирнокислотного состава суммы связанных и прочносвязанных липидов одну часть образца исходного материала обрабатывают диэтиловым эфиром в соотношении 1:10 на механической качалке в течение 3 ч с трехкратной заменой растворителя. Параллельно другую часть (200 мг образца обрабатывают хлороформ-метанольной смесью (2:1). Для экстракции берут десятикратное количество растворителя, экстракцию проводят в три стадии. Продолжительность каждой .стадии 1 ч. DlpoTH, полученные после обработки 1-й и 2-й части образца, высушивают до постоянного веса. Р третью часть образца и шроты вводят внутренний стандарт (2,0%-ный раствор арахиновой кислоты в хлороформе) и обрабатывают полученные образцы 5 мг ацетилхлорида и 2,5 м метанола. Жидкую фазу упаривают на песчаной бане при 80+3°G, после чего в каждую пробу вводят 0,1 мл гексана. 1 мкл гексановой вытяжки анализируют на хроматографе. Условия анализа длина колонки 2 м ди аметр 3 мм, сорбент - хроматон N-AW-DMCS (фракция 0,124-0,160 мм) с 20% диэтилекгликольсукцината. Тем пература термостата колонок 170°С, температура испарителя , расход газа-носителя 40 , детектор - плазменно-ионизационный (ПИД). Расход водорода 400 смVMHH По хроматограмме жирнокислотного состава общих {cy 1мapныx) липидов определяют площадь полученных пиков и находят содержание отдельных жирных кислот в 1 г исследуемого образца по формуле Ai -V . мг, (1) -де S; - площадь пика искомой кисло ты, Явне количество внутреннего ста да.рта, мг; SgH(,- площадь пика внутреннего стандарта, о - навеска исходного образца По хроматограмме метиловых эфиро жирных кислот суммы связанных и про носвязанных липидов, полученных пос ле анализа шрота первой части образ ца, определяют содержание жирных ки кислот (jBj в связанных и прочносвязанных липидах по формуле Si Пвн.с . GI SBH.C Чя где - площадь пика искомой кислоты, мм Sgur- площадь пика внутреннего стандарта, мм навеска внутреннего стандарта, МГ} навеска шрота после обработки исходного образца диэтиловым эфиром, мг. По хроматограмме метиловых эфиро жирных кислот прочносвязанных липидов, содержащихся в последнем шроте, рассчитывают содержание жир ных кислот прочносвязанных липидов по формуле Р , мг, (Л где Чц навеска шрота после снятия суммы связанных и сво бодных липидов, мг} Од - вес шрота, полученного пос ле q6pa6oTKH 1 г исходного образца. Содержание жирных кислот в свободных липидах определяется по разности А ; - в Содержание жирных кислот в связанных липидах определяется по формулеВ, - D,. Пример. Объект исследования - воздушно-сухие хлебопекарные дрожжи, содержащие в основном липиды в виде связанных и прочносвяэанных групп. Исходный образец делят на три части. Для определения жирнокислотного состава суммарных липидов к третьей части (100 мг добавляют 2,0%-ного раствора в хлороформе арахиновой кислоты в качестве внутреннего стандарта и обрабатывают 5 мг ацетилхлорида и 2,5 мл метанола. Жидкую фазу упаривают на песчаной бане при 80+3°С, после чего в колбочку добавляют р,1 мл гексана. 1 мкл гексановой вытяжки вводят в хроматограф. Условия анализа; длина колонки 2 м, диаметр 3. мм, сорбент-хроматон NAW-DMCS (фракция 0,124-0,160 мм), с 20% диэтиленгликольсукцината. Температура термостата колонок 17оС, температура испарителя , расход газа-носителя 40 . Детектор пламенно-ионизационный (ПЩЦ. Расход водорода 40 ,воздуха 400 CMVMHH. По хроматограмме жирнокислотного состава сумм1 рных липидов хлебопекарных дрожжей. Определив площадь полученных пиков, находят содержание отдельных жирных кислот в 1 г хлебопекарных дрожжей по формуле (1. i Для определения жирнокислотного состава суммы связанных и прочносвяIзанных липидов первую часть (200 MrJ исходного материала обрабатывают диэтиловым эфиром в соотношении 1:10 на механической качалке в течение 3 ч с трехкратной заменой растворителя. Полученный шрот высушивают до постоянного веса и липиды, оставшиеся в шроте, обрабатывают 5 мг ацетилхлорида и 2,5 мл метанола с последующим хроматографированием в указанных условиях. По хроматограмме метиловых эфиров жирных кислот суммы связанных и прочносвязанных липидов определяют содержание жирных кислот в связанных и прочносвязанных липидах по формуле (.2) . Содержание жирных кислот в своводных липидах определяют по разности (см. формулу 4 ).

Для определений жирнокислотного состава связанных и прочносвязанных липидов первую часть исходного образца (200 мг) обрабатывают хлороформ-метанольной смесью (2:1), исходный образец - растворитель в соотношении 1:10, в течение 3 ч с трехкратной заменой растворителя. Шрот высушивают до постоянного веса обрабатывают 5 мг ацетилхлорида и 2,5 мл метанола и хроматографируют в указанных условиях.

По хроматограмме метиловых эфиров -жирных кислот прочносвязанных липидов, содержащихся в последнем шроте f рассчитывают содержание жирных кислот прочносвязанных липидов по формуле (3).

Содержание жирных кислот в связанных липидах определяется по разности (см, формулу 5.).

Результаты анализов и расчетов сведены в таблицу.

СПОСОБ- ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИРНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА ЛИПИДОВ ПРИРОДНЫХ ОБЪЕКТОВ, включающий обработку исследуемого образца растворителями с различной полярно- , стью, отделение липидсодержащего экстракта- от шрота с последукчцей отгонкой растворителя, обработку липидов метанолом и ацетилхлоридом, о тл и чающий с я тем, что, с целью сокращения времени анал11за, ,исследуемый образец делят на три части, обработке растворителем параллельно подвергают две из них, используя в качестве растворителя при обработке первой части диэтиловый эфир с получением метиловых эфнров жирных кислот суммы связанных и прочносвязанных ЛИПИДОВ, второй части - хлорог форм-метанольную смесь в соотношении 2:1 с получением метиловых эфиров жирных кислот прочносвязанных ЛИПИДОВ, третью часть непосредственно обрабатывают ацетилхлоридом и ме танолом с получением метиловых эфиров жирйых кислот суммарных липидов, шроты, полученные после обработки первых двух частей, также обрабатывают ацетилхлоридом и метанолом, метило- i « ,вые эфиры жирных кислот, полученные (Л после обработки каждой части и шротов хроматографируют отдельно, при этом F содержание жирных кислот свободных ЛИПИДОВ определяют по разности содержания жирных кислот, полученных послеS обработки третьей и первой частей, содержание жирных кислот связанных ЛИПИДОВ определяют по разности содержания жирных кислотi полученных :л после обработки первой и второй частей исследуемого образца. ч sl

.Использование предлагаемого спр.соба по .сравнению с прототипом позволяет уменьшить продолжительность определения жирнокислотного состава .различных групп липидов в 4-8 раз (с 47 ч до 14-5 ч) и повысить точность анализа в 1,5-3 раза за счет сокращения количества операций (с 30 до 20), что способствует уменьшению потерь исследуемого образца, и параллельно с этим сократить расход реактивов в 2-7 раз.