Способ получения арахидоновой кислоты Советский патент 1985 года по МПК A61K35/68 A61K31/20 

00 Г Изобретение относится к фармацевтической и медицинской проьашшенности и касается способа получения биологически активного средства. Известен способ получения арахидоновой кислоты из липидов прджелудочной железы экстракцией изопропило вым спиртом омылением, подкислением последукнцей экстракцией хлороформом и его отгонкой многоступенчатой низкотемпературной кристаллизацией, кристаллизацией с мочевиной в метано ле, отгонкой метанола и хроматографированием в тонком слое силикагеля l .. Недостатками способу, являются неэкономичность из-за дефицита природного сырья липидов, нетбхнологичность (использование хроматографии в тонком Ьлое), усложненность способа, невысокий выход и невысокое качество целевого продукта (из 800 г липидов получают 1,45-1,55 г арахидоновой кислоты с чистотой 90-95%). Известен также способ получения арахидоновой кислоты из липидов надпочечников крупного рогатого скота, в котором липиды омыляют, подвергают низкотемпературной кристаллизации, зтерифицируют и внов омыпяют. Полученную после омыления смесь высших жирных кислот далее подвергают кристаллизации при температуре О - -5 С, из жидкой фазы извлекают неомыпяемую часть липидов экстракцией петролейным эфиром, оставшуюся жидкую фазу подкисляют минеральной кислотой, из полученной реакционной массы экстрагируют жирные кислоты петролейным эфиром, экстракт подвергают кристаллизации при t -28 - , а затем при t -75 - -78°С, петролейный эфир отгоняют, полученную смесь кислот подвергают кристаллизации в ацетоне при t -77 - -78с с последующей его отгонкой, полученный при этом концентрат арахидоновой кислоты этерифицируют метиловым спиртом и очищают хроматографией на силикагеле, импрег нированном AgNOg в колонке с исполь аованием в качестве элюэнта гексана или диэтилового эфира, причем послед ний берут в количестве 5-100% от веса гексана. Из полученного концент рата метиловых эфиров.выделяют аращдоновую кислоту путем испарения элюэнта с последующим щелочным гидро лизом, экстракцией петролейным эфиром, подкислением полученной реакционной смеси минеральной кислотой и экстракцией арахидоновой кислоты петролейным эфиром 2 . Недостатками известного способа являются усложненность процесса, неэкономичность вследствие дефицита природного сьфья, невысокий выход и недостаточно высокая чистота целевого продукта (из 250 г липидов надпочечников получают 5-6 г арахидоновой кислоты с чистотой 95-97%), Целью изобретения является повышение выхода и чистоты целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения арахидоновой кислоты, включающему обработку липидов водным раствором .щелочи,, подкисление, экстракцию целевого продукта органическим растворителем, охлаждение полученного экстракта, последующую его хроматографию на колонке с силикагелем, импрегнированным нитратом серебра и обработку щелочью, после экстрагирования липидов жгутикового простейшего Astasia Bonga смесью хлороформ-метанол в соотношении 2:1, обработку липидов водным раствором щелочи проводят в этиловом спирте, экстракцию целевого продукта проводят хлороформом, растворитель удаляют, образовавшийся остаток растворяют в ацетоне, прибавляют к мочевине и проводят хроматографию на колонке при соотношении смеси высших жирных кислот и адсорбента (1:120)-(1:150). Пример1.8,0 г липидов жгутикового простейшего Astasia Ponga экстрагируют смесью хлороформ:метаиол 2:1, подвергают щелочному гидролизу в водно-этиловом (1:1) растворе, исходя из расчета 0,25 г NaOH на 1 г липидов. Реакцию проводят 3 ч с обратным холодильником при t бани 5060 С в токе азота. (В дальнейшем все операции проводят в токе азота). Этиловый спирт упаривают, водный раствор подкисляют 10%-нбй серной кислотой до рН 3,5, осадок отфильтровывают, вещество извлекают хлороформом (25 мл хЗ). Органические экстракты объединяют, промывают равным количеством воды, сушат над Na2S04и растворитель удаляют в вакууме. - . Получают смесь жирных кислот 4,2 г с содержанием арахидоновой кислоты 18,3%. Жирные кислоты анализируют методом ГЖХ на хроматографе VarianMod 3700 (USA). Условия разделения: стационарная фаза - 10%-ньй цианпропильный метилсиликон Р-233; пламенно-ионизационный детектор, инертный носитель - хромосорб А 100200 меш; газноситель - гелий: температуру колонки программируют 150220 С, Эту смесь растворяют в 30 мл ацетона, охлаждают до и перемешивают 1 ч, выпавший осадок отделяют. Разделение повторяют при t -20 С Остаток смеси высших ненасыщенных кислот (2,8 г с содержанием ара хидоновой кислоты 38% растворяют в ацетоне и прибавляют при перемеши вании к те.плому раствору мочевины в. ацетоне (11,5 г в 50 мл ацетона) и оставляют на ночь при t -20 С. Выпавший осадок отделяют, фильтрат подкисляют 10% НСС до рН.3,5 и пере мешивают в токе азота 30 мин при t . Реакционную массу охлаж дают, пойиненасыщенные жирные кисло ты извлекают хлороформом (15 мл. х 3 органические экстракты объединяют, промывают 2 раза водой, сушат над и растворитель упаривают в вакууме. Остаток смеси полиненасьпценных жирных кислот (0,9 г с содержанием арахидоновой кислоты 67%) растворяют в to мл безводного метилового спирта насыщенного хлористым водородом и перемешивают Т ч при t +65°С. После охлаждения смеси метанол упаривают, остаток промывают водой, затем 20%ным раствором бикарбоната натрия, жирные кислоты экстрагируют хлорофор мом (25 мл X 3), экстракты сушат и растворитель удаляют в вакууме. Получают 0,84 г смеси метиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот, которые подвергают хроматографии на колонке с силикагелем, импрегированным AgNOj. Адсорбент готовят следующим образом. . К нагретому до раствору AgNO в дистиллированной воде, прибавляют силикагель марки 100/250 меш (соотношение силикагеля и AgNO 2:1), интенсивно перемешивают 15 мин,.фильтруют и массу активируют 12 ч при t . Затем адсорбент охлаждают, добавляют к нему при перемешивании петролейный эфир и-переносят в колонку длиной 100 см и диаметром 35 см. Смесь метиловых эфиров жирных кислот (0,84 г с содержанием .арахидоновой кислоты 67%) растворяют в 10 мл петролейного эфира и наносят на колонку (соотношение нисших жирных кислот ВЖК и адсорбента 1:120). Вещество элюируют последовательно петролейным эфиром, смесями: диэтиловый эфир - петролейный эфир (0,5:99,5), (1:99), (4:96), (1:9) объем фракций от 50 до 10 мл. Фракции, содержаире метйларакинодат чисто ой 98% (анализируют методами ТСХ и ГЖХ) объединяют. Элюэнт упариваЕют и получают 0, метиларахидоната указанной чистоты. Строение арахидоновой кислоты доказано масс-спектрометрией. Для анализа получали пирролидидовые производные жирных кислот. Массспектрометрические исследования про- водрши на хромато-масс-спектрометре Фйнниган - 3200 F с автоматической системой обработки данных (энергия ионизирующих электронов 70 эВ, диапазон массовых чисел 40-420 а.е.м.., температура источника ионов 120 С. ,В максимумах пиков, реконструированных с помощью ЭВМ хроматограмм, определяли времена удерживания и соотношения пиков характеристических ионов в масс-спектре. Эти параметры, а в ряде случаев и полные масс-спектры, использовали для идентификации жирньтх кислот. П р и м е р 2. 6,8 лип5адав жгутикового .простейшего A.Honga подвергают щелочно гу гидролизу как в примере 1 и получают 3,53 г смеси жирных кислот с содержанием арахидоновой кислоты 20%. Эту смесь кристаллизуют последовательно из ацетона При t и при t , согласно примера 1 и получают остаток ненасыщенных жирных кислот 2,3 г с содержанием арахидоновой кислоты 37,5%. Этот остаток кристаллизуют с мочевиной в ацетоне как в примере 1 и получают 0,71 г смеси по.пиненасыщенных жирных кислот, содержащих 65% арахинрновой кислоты, которую этерифицируют по примеру 1 и получают 0,65 г метиловых эфирен полиненасыщенных жирных кислот. Метиловые эфиры ВЖК подвергают ЗсооматогоаФии на колонке с силикагелем, импрегнированным нитратом серевS11329476

pa (соотношение эфиров ВЖК и адсор- В предлагаемом способе также отбента 1:150, элюируют как в приме-сутствуют сверхнизкие температуры

ре 1. Получают 0,34 г мeтилapiaxидoнa--30 - -70 С. требукяцие затрат больта с чистотой 99%.шик энергий. Арахидоновую кислоту

Предлагаемый способ проще и эконо- 5получают с большей чистотой и с больмичней, чем известный, так как имеетшим выходом. В способе используется

7 стадий вместо 8.сырье непищевого назначения.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРАХИДОНОВОЙ КИСЛОТЫ, включаюпшй обработку липидов водным раствором щелочиj йодкисление, экстракцию целевого продукTfa органическим растворителем,охлаждение полученного экстракта, последующую его хроматографию на колонке с силикагелем, импрегнированным нитратом серебра, и обработку щелочью, отличающийся тем, что, с целью повышений чистоты и выхода целевого продукта, после экстрагирования липидов жгутикового простейшего Astasia fonga смесью хлороформ метан.ол в соотношении 2:1, обработку липидовводным раствором щелочи проводят в этиловом .спирте, экстракцию целевого продукта проводят хлоро& формом, растворитель удаляют, обра(Л зовавшийся остаток растворяют в ацетоне, прибавляют к мочевине и проводят хроматографию на колонке при соотношении смеси высших жирных кислот § и адсорбента