Способ количественного определения жирнокислотного состава липидов микроорганизмов Советский патент 1984 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к микробио логической промьшшенности, а именно к способу количественного определения жирнокислотного состава липидов микроорганизмов. Известен способ количественного определения жирнокислотного состава липидов/микроорганизмов, предусматривающий обработку биомассы при нагревании с последующим анализом реакционной смеси методом газовой хроматографии m. Обработку биомассы ведут методом сопиролиза, согласно которому био массу обрабатывают раствором гидроокиси тетраметиламмония и нагревают при 120-140 с, полученную реакционную смесь подвергают пиролизу в испарителе хроматографа, нагретом до 350°С, Недостатком данного способа является отсутствие возможности количественного определения полиненасыщенных жирных кислот, что ограничивает область применения спо соба определением жирнокислотного составабактерий, которые такие кислоты не содержат. Известен также способ количественного определения жирнокислотного состава липидов микроорганизмов, предусматривакщ|ий последовательную обработку биомассы при нагр вании ацетилхлоридом и метанолом, при соотношении биомасса-ацетилхлорид-метанол 100:(50-60):(180-220 удаление жидкой фазы, обработку сух го остатка гексаном и анализ гексановой вытяжки методом газовой хроматографии 2 . , Недостатком известного способа является невысокая точность анализа при определении содержания жирных кислот методом внутреннего стандарта. Цель изобретения - увеличение точности анализа. Указанная цель достигается тем, что согласно способу количественного определения жирнокислотного состава липидов микроорганизмов, предусматривающему последовательную обработку биомассы при нагревании ацетилхлоридом и метанолом при соотношении биомасса-ацетил-хлоридметанол 100:(50-60):(180-220), удаление жидкой фазы, обработку сух го остатка гексаном и анализ гексановой вытяжки методом газовой хроматографии, перед обработкой биомассы ацетилхлоридом ее подвергают обезвоживаний путем последовательно го добавления ацетилхлорида, нагревания при 5Q-52f добавления гептана и кипячения до удаления y tcycной кислоты с последующим введением внутреннего стандарта и разделением реакционной смеси на две части, в одну из которых добавляют перманганат калия в количестве 5-10 мг на 100 мг сухой биомассы, при этом соотношение биомасса-ацетилхлорид-гептан составляет 1А:(4,3 4,8)А:(8,2-8,6)А, где А - влажность биомассы, %. Способ осуществляют следующим образом. Навеску влажных дрожжей обрабатьшают ацетилхлоридом таким образом, чтобы весовое соотношение влаги, содержащееся в образце, и ацетилхлорида составляло 1:(4,3-4,8). Реакционную смесь нагревают при 50-52 С, происходит реакция образования уксусной кислоты и выделение неб. После этого добавляют гептан в количестве, превшиакщем содержание влаги в образце в 8,,6 раза. Реакционную массу нагревают при 92-95 0 до удаления уксусной кислоты в виде аз«отропа с гептаном. После этого в сухой остаток добавляют внутренний стандарт (например. О,2 мл 2,5%-го раствора арахиновой кислоты) и, разделив пробу на две части, в одну добавляют 5-10 мг перманганата калия в расчете на 100 мг сухой биомассы. Обе пробы подвергают обработке ацетилхлоридом и метанолом таким овразом, чтобы соотношение сухая биомасса: ацетилхлорид:метанол составляло 100:(50-60):(180-220). Жидкую фазу упариэают на песчаной бане при 70-80 С. Сухой остаток в обеих пробах экстрагируют гексаном и гексановые вытяжки подвергают анализу на хроматографе. Нагревание влажной биомассы после несения ацетилхлорида позволяет удаить влагу, содержащуюся в-образце, утем взаимодействия ее с ацетиллоридом. Последний превращается в ксусную кислоту, которая удаляется виде азеотропа с гептаном. Удалеие воды при помощи химической реакции ускоряет процесс сушки образца и позволяет получить точные данные об абсолютном содержании жирных кислот в единице веса сухой био- массы. Деление образца после вне- 5 сения в него BHV реннего стандарта и обработка одной части образца перманганатом калия позволяет повы.ить точность анализа за счет обеспечения достоверной идентификации . О качественного состава жирных кислот, Установлено, что оптимальным количеством перманганата калия является 5-10 мг на 100 мг сухой биомассы.

Пример 1. Анализируют состав 15 жирных кислот липидов хлебопекарных дрожжей, выращенных на отходах производства, этилового спирта. Влажность образца 65%. Влажность определяют в сушильном шкафу при 20 130 С доведением образца до посто- янного веса. В круглодонную колбочку объемом 5 мл помещают точную навеску влажных дрожжей (0,3 г). Для связывания воды добавляют 0,85 г 25 ацетилхлорида (по отногиению к воде 1:4,3). Колбочку с реакционной массой нагревают на песчаной бане при 50-52 G в течение 10 мин с воздушт HbiM хйлодильником в виде шарика. 30 После этого добавляют по 1,60 г гептана ( по отношению к воде 1:8,2) и при нагревании на песчаной бане при 91-95°С удаляли уксусную кислоту, выделившуюся при взаимодей- j, ствии ацетилхлорида с влагой образца, в виде азеотропа с гептаном. После упаривания жидкой фазы в колбочку добавляют 0,2 мн внутрен- него стандарта (2%-ный раствор до арахиновой кислоты в хлороформе), затем, разделив пробу на две части, в одну добавляют 5 мг марганцевокислого калия. Содержимое обеих колбочек обрабатывают ацетилхлори- 45 дом (по 50 мг) и метанолом (по 2,5мл). Жидкую фазу упаривают при 70-80 С на песчаной бане 1 ч. После упаривания жидкой фазы образовавшиеся метиловые эфиры экстрагируют 0,2 мл 50 гексана и гексановую вытяжку вводят в хроматограф с пламеннй-ионизационным детектором марки ЛХМ-8МД. Анализ проводят в остальных колонках длиной 2 м, внутренним SS диаметром А мм, заполненных твердым носителем хроматон Супер с 10% диэтиленгликольсукцинатом. Температура испарителя 220°С, температура термостата колонок 170 С. Газ носитель - гелий, расход через колонку 30 мл/мин. Соотношение расходов газ - носитель : водород:воздух - 1:1:10.

Хроматограммы метиловых эфиров жирных кислот рассчитывают методом внутреннего стандарта..

Полученные результаты представлрны в табл. 1.

Количественное содержание кислот, определенное по предлагаемому способу, в образце влажной биомассы хорошо соответствует контрольному определению, а обработка части пробы КМпОц позволяет точно дифференцировать критические пары: Cfe;3 и .Q , .ОДля пика, соответствукйцего первой паре, не обнаружено уменьшения его площади после обработки КМпО, что указывает на присутствие кислоты C(g.g. Для следующих двух критических пар уменьшение содержания вещесва в пробе уменьшено, что означает

наличие кислот С(g; и Cг(;;4 П р и м е р 2. Анализируют состав жирных кислот липидов хлебопеканых дрожжей, выращенных на мелассе (отходы сахарного производства). Влажность образца 77%. Влажность рпределяют в сушильном шкафу при рысушивании влажного образца до постоянного веса. В круглодонную колбочку объемом 5 мл помещают 0,45 г влажного образца. Для.связывания воды добавляют по 1,60 г ацтилхлорида. Колбочку с coдepжи в IM

нагревают с воздушным холодильником на песчаной бане 10 мин при 50-52с для полного связывания воды После охлаждения в колбочку добавля 2,90 г гептана. Колбочку помещают в песчаную баню с температурой 91-95 с до полного удаления уксусной кислоты. После этого в колбоЧку добавляют 0,2 мл внутреннего стандарта (2,5% раствор арахиновой кислоты в хлороформе) и разделив прбу на две части, в одну из них дополнительно вносят 10 мг марганцевокислого калия. Содержимое обеих колбочек после этого обрабатывают ацетилхлоридом и метиловым спиртом в тех же количествах и условиях, чт и в первом примере. Анализ метиловы 5 эфиров проводят на хроматографе с соблюдением тэх же условий, что и в первом примере. Полученные данные представлены в табл. 2. Пример 3. Анализируют сос тав жирных кислот липидов дрсжжей рода Candida, выращенных на этано ле. Влажность образца 42%. В круглодонную колбочку объемом 5 мл пом щают навеску 0,15 г влажной биомассы, к которой добавляют расчетное количество ацетилхлорида (0,30 Смесь вьщерживают 10 мкн на песчаной бане при 50-52 С с обратным во душйым холодильником. После этого акционную массу охлаждают и добавляют 0,54 г гептана. Для удаления образовавшейся уксусной кислоты смесь нагревают при 92-95 С до исчезнования запаха уксусной кислоты После удаления уксусной кислоты в колбочку добавляют внутренний стан 36 дарт (2%-ный раствор арахиновой кислоты в хлороформе) и, разделив пробу на две части, обрабатыйают ацетилхлоридрм (50 мг) и метанолом (2,5,мл), предварительно добавив в одну из них 7,5 мг КМпО. После упаривания жидкой фазы полученные метиловые эфиры жирных кислот экстрагируют гексаном (0,2 мл) и гексановую вытяж- ку вводят в хроматограф. Условия указаны в предьщущих примерах. Расчет полученных хроматограмм проводят методом внутреннего стандарта. Полученные результаты представлены в табл. 3. Таким образом, предлагаемый способ количественного определения жирнокислотного состава липидов микроорганизмов позволяет повысить точность анализа путем повышения достоверности идентификации отдельных компонентов жирнокислотного спектра. Таблица 1

Продолжение табл. 1

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИРНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА ЛШЩОВ МИКРООРГАНИЗМОВ, предусматривакищий последовательную, обработку биомассы при наг1:)евании ацетилхлоридом и метанолом при соотношении био масса-ацетилхлорид-метанол 100:

«гге

О.о 4:0

):o

Ь: о

--liJI

Таблица 2

12;о

Св-.о 11:0

15:0

1Ь;о

Чм

10

1089123 Продолжение.табл. 2

11

12

1089123 Продолжение табл. 3