Проточный цитофлуориметр Советский патент 1983 года по МПК G01N21/64 A61B10/00 

сл

о:

ПРОТОЧНЫЙ .ЦИТОФЛУОРИМЕТР, содержащий флугоресцентный микроскоп, форсунку для подачи и гидродинамической фокусировки жидкости с исследуемыми клетками, покровное стекло микроскопа, систему для отвода жидкости с клетками, отличающийся тем, что, с целью .повышения точности и .производительности измерений, форсунка размеще на no;q покровньм стеклом, а система отвода жидкости с клетками выполнена в виде полости смачивающегося материала, прикрепленной к нижней поверхности покровного стек,ла под объективом микроскопа, при- р чем для обеспечения стационарного потока жидкости с клетками расстоя- |//% ние от края пятна жидкости на покров-||/| ном стекле до места прикрепления полости составляет величину 0,5 1,0 от ширины пятна.

00

Изобретение относится к технической физике, а именно к аналитической микроскопии, в частности к приборам для биологии и медицины, и наиболее эффективно может быть использовано для скоростного автоматического анализа содержания, клеточных компонентов и иву-чения их физико-химического состояния путем измерения флуоресцентных характеристик большого числа отдельных клеток. Известен проточный цитофлуориметр на базе флуоресцентного мик . роскопа, предназначенный для автоматической регистрации флуоресцентных параметров отдельных клето в составе, клеточной суспензии со скоростью измерения до нескольких тысяч клеток в секунду. В этом при боре взвесь исследуемых клеток пос тупает из капилляра в проточную ка меру, расположенную на предметном столике микроскопа и проходит е током жидкости в горизонтальном на правлении с большой скорост;ью чере поле зрения микрообъектив В моме прохождения клетки перед микрообъе тивом, сфокусированном на определенную плоскость, осуществляется освещение клетки возбуждающими луч ми от источника света на выходе д ,чика излучения фотометрической насадки формируется импульс, амплиту которого пропорциональна интенсивности флуоресценции. Система регис рации проводит анализ амплитудного распределения импульсов и выдает Гистограмму распределения клеток inb интенсивности их свечения. Стаб ;лизация положения горизонтального (потока клеток при их прохождении в поле зрения объектива.осуществл ется с noMoatbK гидродинамической ф кусировки: в камере дод давлением создается горизонтальный ток жидкости, в центре которого располагается капилляр с исследуемыми клетками ll и 2 . Недостатком указанного прибора является малая стабильность положения клеток относительно объектива, в результате чего клетки вькодят за пределы глубины резкости микрообъе тива, что приводит к уменьшению точности измерения. Другим недостат ком прибора является невозможность использования в нем высокоапертурных иммерсионных объективов, .имеющих обычно малое рабочее состояние не позволяющее сфокусироваться на измеряемые клетки через стенку камеры и слой жидкости, находящийся перед клетками. Наиболее близким по техничес1КОЙ сущности к предлагаемому является проточный цитофлуориметр, со держащий флуоресцентный микроскоп, форсунку для подачи и гидродинамичной фокусировки жидкости с исследуемыми клетками, покровное стекло микроскопа, систему для отвода жид-, кости с клетками. В этом устройстве стабильный горизонтальный поток клеток в плоскости фокусировки инвертированного микроскопа.обеспечи.вается гидродинамической фокусировкой клеток в струе жидкости, падающей, под углом на верхнюю поверхность покровного стекла и собираемой с него с помощью отсасывающего насоса з . Недостатком этой конструкции прибора является невозможность использования в нем обычных (неинвертированных ) флуоресцентных микроскопов , которые в частности комплектуются светосильными высокоапертурньми иммерсионными микрообъективамй, необходимыми для точных флуориметрических измерений. Другим недостатком известной конструкции является необходимость использования в ней принудительного (с помощью насоса) отвода жидкости с клетками со дна .камеры, что усложняет конструкцию камеры и пониясает надежность и точность измерения и удобства ее ; эксплуатации. Целью изобретения является повышение точности и производительности измерений. Для достижения цели в проточном цитофлуориметре, содержащем флуоресцентный микроскоп, форсунку для подачи и гидродинамической фокусировки жидкости с исследуемыми клетками, покровное стекло микроскопа, систему для отвода.жидкости с клетками, форсунка размещена под покровкым стеклом, а система отвода жидкости с клетками выполнена в виде полости смачивающего материала, прикрепленной к нижней поверхности -покровного стекла под объективом микроскопа, причем для обеспечения стационарного потока жидкости с клетками расстояние от края пятна жидкости на покровном стекле до места прикрепления полости составляет величину 0,5-1,0 от ширины пятна. На чертеже показана принципиальная схема проточного цитофлуориметра. Проточная камера состоит из корпуса 1 и размещенной в ней форсунки 2, Вдоль оси форсунки расположен капилляр 3, по которому подается суспензия клеток. Корпус форсунки имеет патрубок 4 для подачи воды в форсунку. На корпусе камеры закрепляется покровное стекло 5, Полоска смачивающегося материала б закрепляется в верхней части корпуса каме- , ры и касается нижней поверхности

покровного стекла, В нижней части корпуса камеры имеется патрубок 7 для стока воды. Проточная камера крепится на предметном столике 8 флуоресцентного микроскопа. Функциональная схема проточного цитофлуориметра включает- микрообъектив 9, источник 10 света, коллектор 11, полевую диафрагму 12, светофильтры 13 для выделения возбуждающего света, светофильтр 14 для выделения света флуоресценции, интерференционную светоделительную пластинку 15, фотоэлектронный умножитель 16, спектрометрический усилитель 17, многоканальный анализатор 1В импульсов ;

Проточный цитофлуориметр работает следукицим образом.

Суспензия клеток, предварительно меченых флуоресцирующим красителем, подается с постоянной скоростью в центральный капилляр 3 форсунки 2. Одновременно через патрубок 4 в форсунку под давлением 0,6-0,8 атм поступает вода, которая обтекает центральный капилляр 3, пр этом за счет гидродинамической фокусировки клетки в суспензии выстраиваются вдоль оси форсунки. Таким образом, формируется ламинарная коаксиальная струя диаметром 150 мкм, вдоль оси которой выстраивацотся клетки суспензии. Эта струя, несущая клетки, направляется снизу ввер под углом 60-70 на нижнюю поверхность покровного стекла 5.

В месте падения на покровное стекло струя расплющивается и образует пятно эллипсовидной формы, длина и ширина которого зависят |от внутреннего диаметра форсунки, угла падения струи на покровное стекло и давления подачи жидкости, На определенном расстоянии от края пятна по току жидкости .(0,5-1,10 от ширины пятна) .прикрепляется полоса смачивающегося материала 6, с помощью которой жидкость с клетками самото со.м стекает с покровного стекла на дно камеры и затем через патрубок 7 удаляется из нее. Расстояние, на котором прикрепляется полока 6, достаточно для того, чтобы бьшо исключено возникновение значительной турбулентности при ударе жидкости о полоску, и в то же время это расстояние не слишком велико, иначе на нижней поверхности покровного стекла до полоски будет

|равномерный ток жидкости. Для обеспечения стационарного потока жид- кости расстояние от края пятна жидкости на покровном стекле до места прикрепления полоски должно составлять величину 0/5-1,0 от ширины пятна, что при диаметре выходного отверстия форсунки 150 мкм, угле паде.ния жидкости на покровное стекло 60-70° и давлении подачи жидкости

0 0,6-0,8 атм соответствует 1-2 мм и общему расстоянию от места Дс1дения I струи до места прикрепления полоски смачивающего материала 3-4 мм. При этом в поле зрения микрообъектива

5 9 формируется стабильный поток клеток, во время нахождения клетки в после зрения объектива возбуждается флуоресценция красителя, связанного с определенным внутриклеточным ве.ществом (например, ДНК, белком).

0 Источником возбуждающего флуоресценцию света является ртутная лампа 10. Свет от нее собирается коллектором 11 и при noMOuyi интерференционной светоделительной пластинки 15 направ5ляется через микрообъектив 9 на исследуемые клетки. Светофильтры 13 и 14 вьщеляют полосы возбуждения и флуоресценции соответственно. Фотоэлект ронный умножитель 16 преобразует

0 световые сигналы свечения клеток, пересекающих поле зрения микроско-.па, в электрические, которые затем усиливаются с помощью спектрометрического усилителя 17 и поступают на

5 вход многоканального амплитудного анализатора 18. В результате амплитудного анализа получается гистограмма распределения измеряемого в клетках вещества.

0

Таким образом, предлагаемое устройство может быть установлено нг предметном столике любого серийного флуоресцентного микроскопа, прев5ращая: его при соответствующей комплектации прс 1ьвш1енности электронными блоками в прибор для скоростного автоматического анализа свойств клеток. Кроме того, это устройство проще известного по конструкции

0 и в изготовлении, так как насос, применяемый в известном устройстве для отвода жидкости с клетками, заменен полоской смачивающегося материала, благодаря чему сбор ско5пившейся на покровном стекле жидкости с клетками осуществляется самотоком.