Камера для электрофизиологических исследований микрообъектов Советский патент 1985 года по МПК C12M1/00 

Изобретение относится к электрофизиологии и биофизике, а именно к технике электрофизиологических иссл дований живых биологических микрообъектов с применением микроскопии и техники микроманипуляции и предна начено преимущественно для исследования отдельных клеток и клеточных органовидов, в частности особо нежных микрообъектов,, а именно изолированных вакуолей и капель изолированной протоплазмы клеток растени Известна камера для одновременны микроскопических и электрофизиологи ческих исследований препаратов живы тканей и клеток, содержащая корпус и пластмассы, стеклянное дно, каналы дл подачи и отвода растворов JJ , I Однако камера не позволяет проводить Исследования особо нежных микрообъектов, таких как изолирован ные органоиды. В камере отсутствует -верхнее покровное стекло, вследстви чего, камеру нельзя использовать пр работе с обычным микроскопом (необходим инвертированный микроскоп). Камера не приспособлена для термостабилизации раствора. Известна камера для электрофизио логических исследований, которая содержит основание камеры, экспериментальную кювету, трубки подачи и отвода раствора и покровные стекла Недостатком камеры является то, что камера не приспособлена для работы в условиях высокой чистоты эксперимента, а также для быстрой смены в ходе опыта исследуемых микрообъектов, так как экспериментальная кювета вьшолнена как единое целое со всей камерой, а для смены образцов необходима тщательная очис ка поверхности, на которой укреплен микрообъекты. Кроме того, в камере невозможно во время эксперимента разорвать цепь раствора при сохране нии условий термостабилизации для исследуемых микрообъектов. Разрыв цепи потока необходим для электрической изоляции объема раствора в с целью устранения наводок н вхбд измерительного прибора, попада ющих по цепи протока раствора при тех экспериментах, где электрод сра нения должен находиться внутри микроэлектрода, вводимого внутрь иссле дуемого микрообъекта (клетки, органоида) . В противном случае цепь. протока, имеющая значительные размеры, будет подключена к входу измерительного прибора через делитель напряжения, состоящий из сопротивления измеряемого объекта и сопротивления микрозлектрода сравнения. Это вызывает значительные искажения исследуемого сигнала и может привести к разрушению мембраны исследуемого микрообъекта за счет электрического пробоя. Если в камере перед опытом для достижения электрической изоляции объекта разорвать цепь протока, отсоединив трубки подачи и отвода растйора, то во время эксперимента невозможна замена физиологического раствора в кювете и термостабили.зация исследуемых объектов. Отсоеди-;; нять трубки подачи и отвода во время опыта нельзя, так как при этом любое неосторожное сотрясение камеры может вызвать .разрушения микрообъектов и поломку микроинструмента. Цель изобретения - обеспечение электрической изоляции и термостабилизации исследуемого объекта. Цель достигается тем, что камера, содержащая основание, трубки для подачи и отвода физиологического раствора, экспериментальную кювету для размещения микрообъектов и покровные стекла, дополнительно снабжена направляющей и держателем с винтом для перемещения последнего, экспериментальная кювета выполнена в виде съемного блока, состоящего из двух пластин, соединенных перегородками, одна из пластин имеет отверстия для введения трубок для подачи и отвода физиологическогораствора, при этом покровные стекла размещены снизу и сверху пластин, кювета укреплена при помощи винта на основании, в последнем под кюветой выполнена полость для теплоносителя, отделенная от верхней поверхности осноания перегородкой, а трубки для подачи и отвода раствора укреплены на держателе . На фиг. 1 приведена камера, общий вид; на фиг, 2 - съемная эксперимен- тальная кювета, основание камеры с трубками подачи и отвода раствора и устройство для их перемещения. Камера имеет основание 1, изготовленное из органического стекла, в котором расположена полость 2, предназначенная для пропускания

теплоносителя - воды. Штуцера 3, отверстия которых соединены с полостью 2, служат для подсоединения шлангов от термостата. Верхняя стенка полости 2 выполнена из тонкого органического стекла толщиной 1 мм (для улучшения теплопередачи между теплоносителем и экспериментальной кюветой). На плоскости основания 1 расположен держатель А с закрепленными трубками подачи 5 и отвода 6 фИ зиологического раствора, С одной стороны держатель 4 входит в паз направляющей 7, а с другой имеет отверстие с резьбой. В отверстие ввинчен винт подачи держателя 8, жестко укрепленный в подшипнике 9 скольжения, который установлен в выступе основания 1. Трубки подачи 5 и отвода 6 раствора изготовлены из полихлорвинила и имеют на конце конусообразную форму. Трубка подачи 5 соединена резиновой силиконовой трубкой 10 с капилляром 11, пропущенным через полость 2 в основании 1 Съемная экспериментальная кювета состоит из двух пластин 12 и 13, выполненных из органического стекла и соединенных между собой перегородками 14. Сверху и снизу кюветы при помощи чистого вакуумного масла укреплены покровные стекла 15. Пространство между пластинами 12 и 13 и покровными стеклами 15 образует полость 16.. Правая прямоугольная пластина 12 имеет в торце два отверстия 17 для введения трубок подачи 5 и отвода 6 раствора. Левая пластина 13 имеет прорезь 18 для крепления кюветы винтом 19 к основанию 1. Камера укреплена на препаратоводителе микроскопа типа Биолам или любого другого, имеющего препаратоводитель, который установлен на микроманипуляторе ..

Камера работает следующим образом

В кювете полость 16 заполняют физиологический раствором и помещают исследуемые микрообъекты, которые прилипают к предварительно очищенному покровному стеклу 15 (к верхнему или нижнему в зависимости от необходимости). Кювету укрепляют при помощи винта 19 на основании 1. Трубки подачи 5 и отвода 6 раствора при помощи винта подачи держателя 8 вводят

отверстия 17 кюветы. За счет конусообразной формы трубки 5 и 6 плотно входят в отверстия f7 и утечек раствора не происходит. Включают проточную систему. Микроинструменты вводят в полость 16 кюветы с торцов. При необходимости электрической изоляции объема раствора в полости 16 кюветы от раствора в проточной системе проток выключают и отводят трубки подачи 5 и отвода 6 раствора от кюветы при помощи винта подачи держателя 8. Смену объектов в ходе эксперимента проводят путем замены ранее установленной экспериментальной кюветы на другую с предварительно помещенньми в ней новьми объектами. Термостабилизацию раствора в полости 16 кюветы осуществляют как за счет пропускания раствора через капилляр 11, помещенный в полость 2 основания 1, в котором протекает теплоноситель, так и за счет теплопередачи от основания 1 к кювете.

Предлагаемая камера имеет следующие преимущества. Конструкция камеры позволяет проводить электрофизиологические исследова.ния в условиях высокой чистоты эксперимента на особо нежных микрообъектах, таких как, например, изолированные вакуоли растений под микроскопом при помощи микроманипулятрра,-горизонтальным способом введения микроинструмента. Применение съемной кюветы позволяет проводить быструю замену исследуемого объекта (вместе с кюветой) в ходе опыта. Конструкция камеры обеспечивает термостабилизацию микрообъектов в кювете, как при прокачке физиологического раствора, так и без таковой. Кроме того, камер,а позволяет производить электрическую изоляцию раствора в кювете в ходе эксперимента путем разрыва цепи потока раствора. Этот прием дает возможность устранить наводки, попадающие на вход измерительных приборов через цепь протока раствора в тех экспериментах, где электрод сравнения должен находиться внуТри микропипетки (микроэлектрода), вводимой в исследуемую клетку или органоиод (например, при электрофоретической аппликации веществ внутрь клетки).

Фиг. 2

КАМЕРА ДЛЯ. ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ МИКРООВЪЕКТОВ, содержащая основание, трубки для подачи и отвода физиологического раствора, -экспериментальную кювету для размещения микрообъектов и покровные стекла, о т л и ч а ющ а я с я тем, что, с целью обеспечения электрической изоляции и термостабилизации исследуемого объекта, она дополнительно снабжена направляющей и держателем с винтом для перемещения последнего, экспериментальная кювета выполнена в виде съемного блока, состоящего из двух пластин, соединенных перегородкой, одна из пластин имеет отверстия для введения трубок для подачи и отвода физиологического раствора, при этом покровные стекла размещены сверху и снизу пластин, кювета укреплена при помощи винта на основании, в последнем под кюветой выпол(Л нена полость для теплоносителя, отделенная от верхней поверхности основания перегородкой, а трубки для подачи и отвода раствора укреплены на держателе.