Проточный цитофлуориметр-сортировщик клеток Советский патент 1986 года по МПК G01N21/64 

Изобретение относится к технической физике, а именно к аналитической микрофлуориметрии, в частности к приборам для биологии и медицины, и наиболее эффективно может быть использова{ о для скоростного анализа флуоресценции и автоматической сортировки клеток и клеточных органелл, отличаюпщхся по флуоресцентным характеристикам. Цель изобретения - увеличение чувствительности и точности измерений флуоресценции проточным дитофлуориметром-сортировщиком клеток. Иа фиг, 1 представлена схема про точного цитофтГуориметра-сортировщика клеток, содержащая источник света 1, коллектор 2, светофильтр 3 дл выделения света возбуждения, светоделительную интерференционную пластинку 4, иммерсионный микрообъектив 5 (1, 2, 4, 5.- узлы эпи-возбуждения и сбора флуоресценции) проточную камеру 6 с гидродинамической фокусировкой, капилляр 7, светофильтр 8 для выделения света флуоресценции, фотоэлектронный умножитель 9 для выделения света йшуоресценции, фотоэлектронный умножитель 9 (ФЭУ), сиетему анализа и управления сортировкой кдеток 10, пьезоэлектрический преобразователь 11, систему сбора и -разделения клеток., содержащу о отклоняющие пластины 12, резервуар 13 сбора клеток, На фиг. 2 представлены результат анализа суспензии лимфоцитов мьши, окращенных ДНК специфичным флуоресцентным красителем, Пик В получен при анализе суспен зии в стеклянном капилляре через объектив ,25 с масляной иммерси ей, а пик А - на той же суспензии клеток, но в режиме анализа в струе в воздухе: эпи-возбуждейие и сбор флуоресценции происходили через объ ектив АО «0,65 в струе В воздухе при выходе последней цз капилляра.Остальные условия анализа в обоих сл чаях быпи одинаковыми. C.V, - коэффициент вариации интенсивности флуоресценции. На фиг. 3 представлены гистограм мы распределения суспензии культуры клеток глиомы человека по содержани ДНК (по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции клеток (отн. ед.О, п оси ординат количество клеток). Гистограмма А получена на исходной суспензии клеток, подвергнутой сортировке. Гистограммь В и В представляют расцределение клеток по содержанию ДНК в суспензиях, полученных в результате сортировки клеток исходной суспензии на фракции, соответствующие по содержанию ДНК пикам 1 и 2, Изобретение осуществляется следующим образом. Свет от источника свега 1 собирается коллектором 2, проходит через светофильтр 3, служащий для выделения возбуждающего света, и направляется интерференционной светоделительной плactинкoй 4 в иммерсионный микрообъектив 5, Исследу€;мая суспензия клеток, предварительно окрашенных флуоресцентным краситепем, вытекает из проточной камеры 6 lepea стеклянный капилляр 7, ось которого расположена в поле зрения иммерсионного микрообъектива 5. Возбуждающий свет вызывает флуоресценцию клеток,свет которой собирается микрообъективом 5, проходит через светофильтр для выделения флуоресценции 8 и поступает на ФЭУ 9, Сигналы флуоресценции клеток преобразуются в электрические импульсы и подаются в систему анализа и управления сортировкой 10, На выходе капилляра 7 формируетс%струя в воздухе, несущая клетки. Пьезоэлектрический преобразователь 11, механически связанный с проточной камерой 6, разбивает струю на капли. После появления клетки с интересующими флуоресцентными параметрами система анализа и управления сортировкой 10 вырабатьгоает прямоугольный импульс, задержанный по времени от момента регистрации данной о клетки на время, необходимое ей для достижения точки разбиения струи на капли. В течение импульса образуется 4-5 капель, в одной из которых находится клетка, которую надо отсортировать. Импульс заряжает струю, и в результате отделяющиеся капли оказьшаются заряженными, и, двигаясь между отклоняющими пластинами 1 2, в постоянном электрическом поле, отклоняются и попадают в резервудр 13 для сбора клеток. Прибор изготовлен на базе люминесцентного микроскопа МЛ-2, В качестве источника возбуждающего света применена ртутная лампа сверхвысокого давления ДРШ-250-2, питаемая от источника постоянного тока , Воз буждение и сбор флуоресценции производится через микрообъектив 90 1,25 с масляной иммерсией. Выход проточной камеры выполнен в виде цилиндрического капилляра. Для данного микрообъектива использован капилляр с внутренним около 150 мкм и наружным около 450 мкм диаметром, Флуоресценция клеток регистрируется с помощью фотоэлектронного умно}кителя ФЭУ-118. Система амплитудного анализа и управления сортировкой содержит многоканальный амплитудный анализатор АИ-1024-95, блок формирования задерж ки зарядного импульса, ультразвуковой генератор для питания пьезоэлектрического преобразователя и источни ка высокого напряжения, подаваемого на отклоняющие пластины. В качестве резервуара для сббра клеток применены центрифужные пробирки объемом 5 мл. Проточная камера, отклоняющие пластины и резервуар для сбора клеток крепятся на предметном столике микроскопа. Выведение объектива на ось капилляра производится с помощью препаратоводителя, На данном проточноь цитофлуоримет ре-сортировщике клеток было оценено увеличение чувствительности предлага емого устройства по сравнению с прототипом. На фиг, 2 показаны результаты анализа суспензии лимфоцитов мыши, окрашенных ДНК - специфичным красителем. Пик Б получен при возбуж дении и сборе флуоресценции через микрообъектив 90 1,25 с масляной, иммерсией в капилляре. Пик-А получен на той же суспензии клеток, но в режиме анализа в струе в воздухе, сход ным с режимом, примененным в прототи пе: эпи-возбуждение и сбор флуоресценции происходили через суховоздушный микрообъектив 40«0,65 (в прототипе 32x0,60) в струе в воздухе при выходе последней из капилляра. Остальные условия эксперимента в обоих случаях одинаковы. Сравнение ве- личин сигналов флуоресценции и коэффициентов вариации, рассчитанных для пиков А и Б (фиг, 2), показало, что чувствительность предлагаемого устройства приблизительно в 9 раз выше по сравнение с чувствительностью прототипа при одновременном увеличении точности анализа, определяемой по коэффициенту вариации приблизительно в 3,5 раза. На проточном цитометре-сортировщике клеток была проведена сортировка суспензии клеток по содержанию ДНК (фиг, 3). Чистота отсортированных фракций (Б, в) составила 93%, Формула изобретени.я Проточный цитос1Шурриметр-сортиров-: щик клеток, содерлсащий узел эпивозбуждения и сбора флуоресценции, на выходе которого установлен микрообъектив , проточную камеру с гидродинамической фокусировкой суспензии клеток, корпус которой механически свя зан с пьезоэлектрическим преобразователем, систему анализа и управления сортировкой клеток, причем.на выходе камеры установлена система сбора и разделения клеток, отличающийся тем, что, с целью увеличения чувствительности и точности измерений флуоресценции, выход проточной камеры вьшолнен в виде капилляра, ось которого расположена в поле зрения мшсрообъектива, выполненного, иммерсионным и высокоапертурным.

V

ifex

Z

n

Vut.f

ctr

-

IхЗ

-I ,J

Изобретение относится к области технической физики, а именно, к аналитической микрофлуориметрии. Целью изобретения является увеличение чувствительности и точности измерений флуоресценции проточным цитометром-сортировщиком клеток.Устройство состоит из узла эпивозбуждения и сёора флуоресценции. Проточная камера снабжена гидродинамической фокусировкой суспензии клеток. Вход проточной камеры выполнен в виде капилляра. Узел эпивозбуждения i и сбора флуоресценции содержит высокотемпературный иммерсионный объ(Л ектив . Ось капилляра расположена в поле зрения микрообъектива. 3 ил. to О) 00

Кол-60 клеток

фиг.З

Интенсивность (p i/opeci(€Hmtu(omN,eff)