Способ исследования хромосомного состава клеток Советский патент 1987 года по МПК G01N33/483 

Изобретение относится .к области автоматизированного анализа биологических микрообъектов, в частности к способам быстрого анализа хромосомного состава клеток.

Целью изобретения является повышение информативности способа за счет поклеточной регистрации хромосом.

Способ осуществляют следующим образом.

При пропускании потока клеточной пробы клетки проходят через устройство разбиения. В простейшем случае оно представляет собой капилляр, в котором клетки разбиваются гидродинамическими силами. Для этой цели возможно также использование ультразвукового облучения. В устройство разбиения клетки поступают поочередно. Это достигается уменьшением их концентрации в суспензии и уменьшением расхода клеточной жидкости до тех пор, пока вероятность одновременного поступления двух клеток не станет пренебрежиМО мала. На выходе из устройства разбиения появляются rpynni i хромосом, принадлежащие отдельным клеткам и идущие друг за другом с некоторым перерывом. Далее хромосомы проходят капилляр, в котором происходит увеличение расстояния между хромосомами в группе (длины группы), чтобы регистрирующая электроника успевала зарегистрировать все хромосомы. Временное распределение клеток, поступающих в устройство разбиения, представляет собой распределение Пуансона. Плотность распределения временных про межутков между клетками (также между группами хромосом) есть P(t) exp(-t/T), где Т - среднее время между прохождением .клеток. Рас пределение хромосом внутри группы также примерно представляет собой распределение Пуансона. Соответствен но плотность распределег-шя временных промежутков между хромосомами внутри группы есть P(t) exp(-t/T ), где Tj(p - среднее время между хромосомами в группе. Из капилляра поклеточные-- группы хромосом поступают в проточную систему цитофлуориметра. Флуоресценция хромосом и время между ними анализируются с помощью регистрирующей системы. Начало поступления хромосом от очередной клети определя ют на основе того, что среднее время между прохождением групп Т, больше в

30-3000 раз, чем среднее время между хромосомами внутри группы. Для этого одновременно с регистрацией флуоресценции хромосом тем или иным способом регистрируют и время между импульсами. По спектру распределения времени между импульсами, содержащему оба временных распределения, выбирают такое граничное время Т , которое больше, чем времена внутри группы и меньше, чем времена между группами . Примерно оно выбирается как Т„ Т . При определении групп хромосом, принадлежащихопределенной клетке, первой хромосомой является та., которая пришла через время,большее, чем ТГР .

Способ поясняется конкретными примерами.

Пример 1. Метафазные клетки китайского хомячка линии CHEL подвергают предварительной обработке с целью окраски и облегчения последующего разрыва клетки и расхождения хромосом. Клетки в суспензии выдерживают для набухания в гипотоническом растворе (75 мМ КС1) 20 мин. Затем их обрабатывают раствором состава: детергент Тритон Х-100 -0,3%, 1 мМ MgClj ; 1 мМ CaClj, : 20 мг красителя этидий бромид, 25 КС,, 25 мМ . Раствор имеет ,0.Время обработки 15 мин. Затем клеточную суспензию с концентрацией не более 10000 клеток в мл осторожно, не допуская преждевременного разрыва их, заливают в насос проточного цитофлуориметра. Из насоса поступает 2050 клеток в, с. Далее клетки проходят через устройство разбиения, представляющее собой капилляр диаметром 100150 мкм, длиной 50 мм. Затем подклеточные группы хромосом проходят через капилляр длиной 60 мм, диаметром 0,3 мм. Капилляр увеличивает длину групп (среднее время между хромосомами внутри группы при этом увеличивается до 0,1 мс). Затем хромосомы поступают в проточную систему цитофлуориметра. Флуоресценция, пропорциональная количеству ДНК в хромосоме, поступает на систему регистрации. Одновременно этой систе уГой также.регистрируется время между импульсами. Из распределения времени между импульсами определяется граничное время Трр . Здесь оно составляет 3 мс. Регистрирующее устройство производит 31 также подсчет хромосом в каждой клет ке. Подсчет хромосом в очередной клетке начинается с хромосомы, время прихода которой по отношению к предьщущей превьшает граничное время (3 мс) и оканчивается той хромосомой следующая за которой приходит через время, большее, чем граничное. Регистрирующая система, используемая здесь, состоит из амплитудного анализатора и набора стандартных элекTpoHHbix блоков. Анализ распределения числа хромосом в клетках, описанньй в этом примере, производится со скоростью 2050 клеток в с и не может быть выполнен другими известными техническими средствами,например по способу прототипа. П р и м е р 2. Метафазные клети китайского хомячка линии CHEL подвер гают предварительной обработке, выполненной так же, как в первом приме ре . Клеточную суспензию готовят в концентрации 5000 клеток в мл. Из на соса подают 30-100 клеток в с. Далее суспензию пропускают через устройство разбиения, представляющее собой капилляр длиной 40 мм, диаметром 100 мкм, внутри которого помещена спираль диаметром 100 мкм. Затем под клеточные группы проходят через капилляр диаметром 0,2 мм, длиной 100 мм, в котором осуществляется рас- „ тяжка длины групп. Импульсы флуоресценции и время между ними регистрируются устройством. Регистрация в 76 данном примере происходит не в виде спектра, а в виде последовательно заполняемых ячеек памяти. импульсы флуоресценции хромосом, записанные последовательно по мере их прихода, объединяют в группы, соответствующие хромосомам отдельных клеток. Для этого строят распределение времен между импульсами и выбирают граничное время Трр аналогично примеру 1. Импульсы флуоресценции, отделенные друг от друга временем большим, чем граничное, относятся к разным кйеткам. В данном примере граничное время составляет 10 мс. Таким образом вьщеляют группы, в которые включены хромосомы, принадлежащие отдельным клеткам. Из работ по проточной цитофлуориметрии известно, что каждая хромосома располагается на спектре в определенной области флуоресценции. Любые отклонения от зтих пределов представляют хромосомные аномалии. Таким образом, если флуоресценция от хромосом попала за пределы зтих областей, или внутри области находится лишнее количество хромосом, это указывает на регистрацию аномальных хромосом. В результате этой обработки получается такая информация, как число клеток в пробе с тем или иным числом хромосомных повреждений. Практически это очень важно, так как адекватно характеризует действие, которое оказывают радиоактивные излучения и мутагенные вещества на генетический аппарат клетки.

СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ .ХРОМОСОМНОГО СОСТАВА КЛЕТОК путем разрушения клеток с последующей регистрацией импульса флуоресценции каждой хромосомы, отличающийся тем, что, с целью поШ)Шения информативлости способа за счет поклеточного анализа хромосом, разрушение клеток проводят пропусканием их через капилляр диаметром, соответствующим диаметру клетки, далее регистрируют интервалы времени между импульсами флуоресценции и по величинам интервалов 3-10 мс между импульсами определяют хромосомы, принадлежащие одной клетке.