Способ определения безвредности пищевых продуктов или техногенных веществ содержащихся в них Советский патент 1983 года по МПК A61B10/00 G01N33/02 

Н

со

Изобретение относится к спсюобам определения безвредности пищевых и техногенных веществ в эксперименте и может найти применение в гигиене Ъитания для оценки действия продуктов питания на организм животного или для установления предельно допустимых концентраций токсических (техногенных) веществ в пищевых продуктах.

Известен способ определения безвредности пищевых, техногенных веществ, который включает следующую последовательность приемов и операций Опытных животнь1х кормят испытуемыми веществами в течение 30 мес.На разных сроках и в конце опыта живот- 15 ных(опытных и контрольных)забивают и берут участки внутренних органов, готовят гистологические препараты и при микроскопическом исследовании препаратов внутренних органов выяв- 20 ляют ту или иную паталъгическук картину,а при отсутствии паталогичес,ких изменений в тканях делают заключение и безвредности действия испытуемых веществ l -25

Недостатком данного способа является невозможность определения вредных изменений, которые не нарушают морфологические структуры клеток и тканей, т. е. способ обладает малой чувстви- jg тёльностью и является описательным, а не количественным методом, Кроме того, он требует длительных сроков исследования.

Целью изобретения является повыше-ос ние чувствительности способа и .сокращение сроков исследования.

Поставленная цель достигается тем, что дозы испытуемых веществ вводят животным в течение 1,5-6 мес,, после чего в течение 1-1,5 мес скармливают обычный рацион, из гистологических препаратов готовят радиоавтографы, микроскопическими исследованиями устанавливают скорость обновления эпителия тонкого кишечника, а пато- 45 логические изменения выявляют при сравнении этого показателя у подопытных животных и животных, не получивших испытуемое вещество.

Сущность способа заключается в том,что скорость обновления эпителия тонкого кищечника уменьшается необратимо с возрастом по экспоненциальнсялу закону. Величина скорости обновления зависит также от интенсивности 55 предшествующего функционирования органа и последняя находится в обратной зависимости от -интенсивности клеточного обновления, поэтому по данному критерию можно количественно оценить 60 степень вредного воздействия или определить безвредность действия испытуемых доз ветдеств.

Пример 1. Определение безвредности пищевых,техногенных веществ,б5

в частности, способ определения безвредности -алканов (техногенных примесей, содержащихся в искусственно создаваемых пищевых белках).

Берут 20 белых крыс в возрасте 1 мес и разбивают их на две равные группы. Опытней группе добавляют ежедневно в корм нормальные алканы в дозе 400 мг на кг массы тела в сутке в течение 5 мес, после чего отменя от дачу N -алканов и опытных животных и контрольных содержат на виварЙом рёщионе в течение 1 мес. В последний день этого периода для установления скорости обновления эпителия тонкого кишечника опытным и контрольным животным вводят внутрибрюшиннонтимидин в дозе 0,5МкКИ на 1 г массытела.Через 24 ч после введения тимидина крыс забивают под эфирным наркозом и вырезают участок тонкого кишечника размером 1-2см, отступя на 2-3 см

от окончания двенадцатиперстной кишки, с помощью шприца в просвет вырезанной кишки вводят 1 МЛ10%-НОГО

ipacTBOpa формалина для быстрой {фиксации ворсин и сохранения на них эпителиальных клеток, далее фиксируют отрезок кишки в 10%-ном растворе формалина в течение 4 сут, промывают в проточной воде,проводят кишку через спиртов восходящей концентрации и заливают отрезок тбнкой кишки в парафцн, при этом плоскость парафинового среза ориентируют 1ерпендикулярно длине кишки.

При забое животных для выявления патогиотологических изменений во внутренних органах берут участки следующих органов: печени, почки, надпочечйика, тимуса, легкого, селезёнки.

Гисторадйоавтографы готовят из поперечных срезов тонкой кишки по стандартной методике 2 . Для этого срезы заливают в темноте фо1оэмульсие типа МР и оставляют их в темноте и в холодильнике на 7 дн.После экйпонирования фотоэмульсии проявляют в метол- гидрохиноновсм проявителе и закрепляют в фиксаже, а после промывки препарата, гисторадиоавтограф подкрашивают гематоксилином Майера.

На полученных гисторадиоавтографах кишки при микроскопическс исследовании определяют скорость обновления эпителия тонкого кишечника для каждого отдельного случая. Для этого на гисуорадиоавтографах регистрируют количествоiK-петок (меченых и Т емеченых) в эпителиальном пласте ксзмп лекса крипта- ворсина. Учет ведут начиная от первой клетки (энтероцита) дна крипты, которая делит последнюю на две симметричные половины, а подсчет ведут вдоль по крипте, переходя затем на ворсину и заканчивают последней меченой клет-i oft на ворсине.Учитывсцот только продольно срезанные комплексы криптаворсина. Массив наблюдений, необходимый для получения достоверной сред ней величины скорости обновления эпителия тонкого кишечника, у одного животного составляет не менее 132 комплексов крипта-ворсина. Для выявления безвредности действия N -алканов микроскопируют присв товленные гистологические препараты внутренних орган.ов; печени, почки, надпочечника, легких, тимуса, селезенки на предмет обнаружения патологических изменений. В исследованных органах опытных и контрольных крыс патологических изменений не было обнаружено... Далее сравнивают значения скоростей обновления эпителия тонкого кише ника опыта и контроля, которые соответственно равны: 52 клетки/сут и 65 клеток/сут.Статистически разниц между ними достоверна ,37 и ,01. Установлено, что скорость обновления эпителия тонкого кишечника у животных опытной группы замедли лась, и соответствует скорости, хар терной для крыс в возрасте 10,5 мес а в контрольной группе животных сред няя величина скорости обновления эп телия соответствует скорости паспор ного возраста, т.е. 7 мес. Можно сделать вывод, что под действием нормальных алканов,: в дозе 400 мг на кг массы тела в сутки при вскарм ливании ими крыс в течение 5 мес, кишка постарела на 150% по сравнению jc контроло л. N -алканы в указанной дозе оказали вредное действие на /организм опытных крыс, тогда как при исследовании приемами и .признаками известного способа выявить вред ного действия не удалось. Пример 2. Определение безвредности пищевого рациона, содержащего белково-витаминный концентрат (БВК) . Испытуемый пищевой рацион представляет собой виварный рацион, в котором 25% белка суточного рациона заменено белком БВК. . -.. . Берут крыс одномесячного возраста 2 группы по 10 животных в каж дой. Опытных крыс кормят испытуемой диетой.в течение 6 мес, после чего опытных животных переводят сроком на 1 мес на виварный рацион.. Контрольная группа животных находится на виварном рационе постоянно, в последний день этого периода для установления скорости обновления эпителия трнко1 о кишечника опытным и контрольным животным вводят внутрибрюшинно Н-тимидин в дозе 0,5 МкКи на 1 г массы тела. Через 24 ч после введения тимидина крыс забивают под эфирным на жозом и вырезают участок тонкого кишечника размером 1-2 см, отступя на 2-3 см от окончания двенадцатиперстной кишки, с помощью шприца в просвет вырезанной кишки вводят 1 мл 10%-ного раствора формалина для быстрой фиксации ворсин и сохранения на них эпителиальных клеток, далее фиксируют отрезок кишки в 10%-ном растворе формалина в течение 4 сут, затем промывают в проточной воде, проводят кишку чер:ез батарею спиртов восходящей концентрации и заливают ее в парафин, при этом плоскость парафинового среза ориентируют перпендикулярно длине кишки. При забое животных -для выявления патогистологических изменений во внутренних органах берут участки следукйцих органов: печени, почки, надпочечника, тимуса, л егкого, селе3 енки. Гисторадиоавтографы готовят из поперечных срезов тонкой кишки по стандартной методике (пример 1).Для этого срезы заливают в фотоэмульсией типа МР и оставляют их в темноте и в холодильнике на 7 дней. После экспонирования фотоэмульсию проявляют в метол-гидррхиноновом проявителе и закрепляют в фиксаже, а после промывки препарата гисторадиоавтограф подкрашивают гематоксилит ном Майера. На полученных гисторадиоавтографах кишки при микроскопическом исследовании определяют скорость Обновление эпителия- тонкого кишеч.ника для каждого отдельного случая, для этого на гисторадиоавтографах регистрируют количество клетбк (меченых, и немеченых) в эпителиальном пласте комплекса крипта-ворсина. Учет ведут наминая от первой клетки (энтероцита) дна крипты, которая делит крипту на две симметричные половины, подсчет - вдоль по крипте, переходя затем на ворсину и заканчивают подсчет последней меченой клеткой на ворсине. Массив наблюдений, необходимый для получения достоверной средней скорости обновления эпителия тонкого кишечника, у одного животного составляет не менее 132 комплексов хрипта-ворсина. Для выявления безвредности действия испытуемого пищевого рациона мик7. роскопируют приготовленные гистологические препараты внутренних органов: печени, почки, надпочечника, легких тимуса, селезенки, на предмет обна- ружения патологических изменений. В исследованных органах опытных и контрольных крыс патологических изменений не было обнаружено. Далее сравнивают значения скоростей, обновления эпителия тонкого кишечника в опыте и контроле.

51061797

Установлено, что величина среднейВВК от общего количества «Уелка суточ

скорости обновления эпителия тонкогоного рациона крыс, обладает беэврелкишечника в контрольной группе живот-ным действием.

rikx составила ,9 клеток/сут, в. Экономический эффект достигается

опыте соответственно 63±1,4клеток/сут,за счет сокращения в 2-3 раза сроков

Разница между средними значениями исследования.

скоростей в опыте и контроле недосто- Положительный эффект не создающий

верна пpиt,2 и ,05. Значенияэкономии, возникает всвязЬ.р изменесредних скоростей в опыте и контролением технолйгии, т.е. за счет испольравны и соответствуют величине ско зования нового теста - скорости обpoQTH обновлекия эпителия тонкого йи-Юновления эпителия тонкого кишечника

шечника их паспортного возраста,для оценки безвредности и выражается

т«е. 8 мае.в возможности дать, количественную

Таким образом, испытуемый пищевойоценку и повысить чувствительность

рацион, содержащий 25%-ного белкаспособа.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЗВРЕДНОСТИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ ИЛИ ТЕХНОГЕННЫХ ВЕЩЕСТВ, СОДЕРЖАЩИХСЯ В НИХ, включающий введение в организм подопытных животных различных доз испытуемого водества, приготовление гистологических препаратов из тканей тонкого кишечника животного и микроскопическое исследование последних для выявления патологических изменений, отличающи йс я тем,что, с целью повышен1Гя чувствительности способа и сокращения срока исследования, дозы испытуемых веществ вводят животным в течение 1,5-6 мес,после чего в течение мес скармливают обычный рацион, из гистологических параметров готовят радиоавтографы, микроскопическими иcqлeдoвaниями устанавливают скорость обновления . эпителия тонкого кишечника,а патолоо гические изменения выявляют при срав-tg нении этого показателя у подопытных (Л животных, не получавших испытуемое вещество.