Способ определения протеолитической активности моющих средств, содержащих ферменты Советский патент 1984 года по МПК G01N21/00 C11D3/386 

Изобретение относится к методам оценки моющей способности моющих средств, а именно к оценке протеоли ической. а1:тивности моющих средств, и может быть использовано для оценки качества мойки оборудования, например, в молочной промышленности.

Моющая способность является одной из основных характеристик моющих средств. В молочной промышленности белки, жиры и углеводы являются основными компонентами загрязнений. В связи с этим при оценке качества моющих средств в молочной промышленности необходимо правильно и оперативно оценить протеолитическую активность моющих средств.

О степени разложения (протеолиза) белков судят, например, по увеличению количества растворимого азота.

Известен способ, определения pact воримого азота, согласно KOTopotviy к 5 мл 5%-ного водного раствора белков добавляют 20 мл моющего раствора и выдерживают 2 ч при . После выдержки добавляют 2 мл нейтрального формалина и титруют 0,1 н. раствором NaOH до рН 9,2 в присутст ВИИ индикаторов - бромтимолового . синего и тимолфталеина. Параллельно проводят опыт с 5 мл 5%-ного водного раствора белков и 20 мл.дистиллирован-ной водил - контрольная проба. Содержание аминного азотав процентах в пересчете на сухой препарат моющего средства вычисляют по формуле fi.

Недостаток указанного способа наличие источника субъективных сяиибок, особенно при титровании и нейтрализации формалина, раствор формалина ядовит, портится при хранении, необходимо применять индикаторы или рН-метр.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому -результату является способ f2j определения протеол« згической активности моющих средств, согласно которому к 2,5 мл 1%-ного водного раствора казеина добавляют 2,5 мл водного раствора исследуемого моющего средства, содержащего протеопитический фермент. Пробирку вьедерживают 60 мин при 40°С, после вьщержки добавляют 5 мл 0,3 М раствора трихпоруксусной кислоты, смесь перемешивают, выдерживают 15 мин при и фильтруют. Далее к 2 мл фильтрата доливают 5 мл 0,5 М раствора углекислого натрия и 1 мл рабочего раствора фолина, выдерживают 30 мин при 40°С и фотометрируют против контроля при длине волны 656-677 им в кюветах шириной 0,5 CM

Контроль готовят так же, только вместо 2,5 мп 1%-ного раствора моющего средг тва в пробирку заливают 2,5 МП дистиллированной воды. Протеолитическую активность рассчитывают по формуле

.

.1000,

ПА

где ПА - протеолитическая активность моющего средства, ед/г;

д - оптическая плотность смеси раствора,

4,7 и 0,1 - постоянные коэффициенты, п - навеока маощего средства,

г, в 2 мл растбора/ 1000 - коэффициент пересчета.

К недостаткам известного способа относятся сложность и длительность определения, наличие множества операций, таких как подготовка растворов реактивов с использованием тринадцати различных химических веществ, введение трихлоруксусной кислоты, нейтрализация гидрокарбонатом натрия, фильтрование, термостатирование, введение реактива Фолина.

Цель изобретения - повьиаение точности , упрощение и ускорение способа опред;еления протеолитической активности моющих средств.

Поставленная цель достигается тем,, что согласно способу определения протеолитической активности моющих средств измеряют оптическую плотность О,1-10%-ного водного раст вора молочного белка и О,1-2,5%-ного водного раствора исследуемой пробы моющего средства, смешивают указанные paoTBOEtJ в объемном соотношении 1-(4-20), подогревают смесь, выдерживают при температуре подогрева и определяют ойтическую плотност смеси с последуюсоим вычислением про теолитической активности моющего средства по формуле

А ..Sj.i-SJiS . 100

(1)

«о

где Дд - оптическая плотность водного раствора белка; Д - оптическая плотность вод- ного раствора моющего средства;

Дя - оптическая плотность смеси водных растворов белка и моющего среде .ва. В качестве белка используют натуральное, сгущенное, сухое цельное или обезжиренное молоко, пахту, сыворотку молочную или продукты, выделенные из них.

Сущность способа заключается в том, что оптическая плотность раствора молочных белков при действии моющих средств снижается. Это снижение вызвано измейением нативного состояния белков в результате их 5 протеолиза, т.е. набухания и расщепления. Оптическая плотность раствора молочных белков снижается под действием монадего средства в диапазоне световых волн в интервале Ю 20-700 нм. Установлено, что снижение оптической плотности раствора белков при одинаковых условиях (тём1пература, концентрация моющего раст-: ора и время/выдержки) бывает раз- 15ным дли моющих средств различного ; состава. В связи с этим в стандартных условиях возможно сравнить моющую спрсрбность моющих средств по V отнсииению к белковым загрязнениям. 20

Способ осуществляют следукицим образом.

Приготавливают водный раствор молочных белков, который содержит 0,1-10% белка, и качестве белков 25 используют натуральное, сгущенное сухо% цельное или обезжиренное молоко, naxty, сыворотку:молочную или

белки выделенные из них. Приготавлива ют водный раствор моквдего сред- 30 ства концентрацией 0,1-2,5%. В три прЪбирки заливаю т одинаковые объелва

раствора белков или дистиллированной

еоды, в первую и - раствор

б елков,. а во вторую - соответствую- 35 щее количество воды. Потсял заливают

в первую пробирку 4-20 объемов (по отношению к объему раствора белков) дистиллированной вода, а во вторую и третью - водного раствора моющего 40 средства, подогретого до 20-90 С, и перемешивают. Третуью пробирку выдерживают от 10 мин до 2,0 ч при С постоянной температуре (20-90 с). Далее определяют оптическую плотность45 растворов при длине волшл ( J ) 200-700 нм в кювете ащриной, преимущественно, 1 см с помощью спектрофотометра или фотокаж иметра. При высокой плотности одного из исслед1уё-50

:мых растворов (более 1,0 всё

. бирки раз бс1вляют 1-10 объемами дистиллированной воды к одному объему смеси из каждой пробирки. Протеолитическую активность моющего средст- 55

ва вычисляют по формуле (1).

Моющее средство является неак- . тивяым по отношению к белкам, если его протеолитическая активность, рассчитанная по формуле, равна 60 нулю, и идеально активным, если приближается к 100%. .

Пример 1. . Готовят 5%-,ный водный раствор сывороточных белков. Сывороточные белки выделены из сы- 5

воротки ультрафильтрацией и высушены. Готовят 1%-ный водный раствор моющего средства Биоэст. Готовят три пробирки, в первую и .третью из них заливают по 5 мл раствора белков,, во вторую 5 мл дистиллированной воды. Далее заливают в первую пробирку 20 мл дистиллированной воды, а во вторую и третью - по 20 мл моющего раствора, подогретого до . Третью пробирку выдерживают в термостате 2 ч при 50°С. После выдержки берут из 1-3-ей пробирок по 5 мл смеси, которую вливают в новые пробирки 1 , 2 , 3 , .залитые 20 мл дистиллированной воды Содержимое пробирок 1, 2 и 3 вымешивают, заливают в кювету шириной 1 см и определяют оптическую плотность при длине световой волны .600 нм на спектрофотометре. Оптическая плотность раствора из пробирок , 2 и 3 составляет соответственно Д. 0,660/ Д 0,014; Д2 0,195. Протеолитическая активность (А) мокяцего средства Биоэсх , рассчитанная по формуле (1, составляет А 72,6%, что свидетельствует о высокой активности моющего : средства к белковым загрязнениям. П р им ер 2. Готовят 10%ный раствор сухого обезжиренного молока и 1%-ный раствор моющего средства Вильва. В первую и третью пробирки заливсшзт 2,5 мл раствора белков, во вторую 2,5 мл дистиллированной воды. Далее в первую пробирку заливают 25 мл дистиллированной воды, а во вторую и третью 25. мл моквдего раствора. Все пробирки выдерживают при комнатной темпе;ратуре 1 ч. После выдержки заливают содержимое пробирок в кювету шириной 1 см .и определяют оптическую ; ПЛОТНОСТЬ) при длине световой волны -500 нм на спектрофотометре. Опти; ческая плотность растворов из проj бирки1, 2, 3 составляет соответст венно 0,96; Д , 0,000; Д2

0,097. Протеолитическая активность моющего средства Вильва, рассчитанная по формуле, составляет А 89,9%, что свидетельствует о высокой активности монндего средства к белковым загрязнениям обезжиренного молока..

Пример 3. Берут сгущенное обезжиренное молоко с -содержанием 20% сухих веществ и готовят 2,5%-ны водный раствор моющего средства Вимол. Готовят три колбы Эрленмеера объемом 50 мл. В первую и третью колбы заливают 1 мл сгущенного обезжиренного молока а во вторую 1 мл дистиллированной воды, потом в первую колбу заливают 20 мл дистиллированной воды, а во вторую

н третью - по 20 мл моющего раствора, пологретого до . Третью колбу выдержи.вают 15 мин при 80 С. После выдержки во все колбы заливают по 20 мл дистиллированноя воды. Содержимое колб перемешивают, за- 5 ливают в кюветы шириной 0,5 dM и определяют оптическую плотность при длине световой волны 700 им на фотокалориметре. Оптическая плотность растг -ров из колб 1, 2 и 3 Ю составляет соответственно До 0,87; Д ji 0,02; Д2 0,59. Протеолитическая активность (А) раствора моющего средства Вимол, рассчитанная по формуле, Составляет А 34,5%, 15 что свидетельствует о средней протеолитической активности указанного средства к белковым загрязнениям.

Пример 4. Готовят 0,1%-ный водный раствор цельного молока и 20 0,1%-ный водный раствор моющего средства Триас-А. Готовят, три конические колбы, в первую и третью колбы заливают по 25 мл водного- раствора цельного молока, а во вторую 25 мл 25 истиллированной воды. Потом в первую колбу заливают 25 мл дистиллированной воды, а во вторую третью - по 25 мл мoющet o раствоа, подогретого до 90°С. Третью кол- JQ у выдерживают 5 мин при 90°С. Посе выдержки и охлаждения содержаие пробирок заливают в кюветы шииной 1,0 см и определяют оптичес ую плотность при длине световой з5 олны 210 нм на спектрофотометре. птическая плотность раствора из колб 1, 2.и 3 составляет соответственно flj, 0,418; Д .j 0,01; Ду 0,384 ротеолитическая активность 0,1%-но- л го раствора моющего средства Триг с-А, расчитанная по формуле, составляет А-8,37%, что свидетельствует о низкой протеолитической активности указанного средства в данных дг условиях к белковым.загрязнениям.

Для сравнения сизвестными способами; методом определения растворимого азота в казеине (метод Зерей сена-Гаврилова) ij и методом оп- сп ределения протеолитической активности ферментов в моющих средствах

(метод 2 проводят испытания,.

1. Пр едла га ем ый сп ос об. Го- 55 товят три пробирки. В первую и третью пробирки заливают по 5 мл 5 %-ного водного раствора сывороточных белков, во вторую 5 мл дистиллированной воды. Далее в первую пробирку зали- Q вают 20 мл дистиллированной воды, а во вторую и третью 20 мл 2,0%-ного водного раств.ора мокяцего средства, подог,ретого до температуры .выдержки. Пробирки перемешивают.

Третью пробирку со смесью водных растворов белков и моющего средства выдерживают 2 ч в термостате. После выдержки берут еще три пробирки 1, 2 З , в которые заливают5 мл соответствующих растворов и 20 мл дистиллированной воды. Оптическую плотность определяют при длине волны Д 600 нм в кювете шириной 1 см на спектрофотометре Specol (ГДР). Протеолитическую активность в процентах вьп1исляют по формуле

..±.SjI-Sj

(1/

100 -До

где А - Протеолитическая активность

моющего средства, %: Дд- оптическая плотность водного раствора белков; Д,|- оптическая плотность водного раствора моющего средства ;

Дй- оптическая плотность смеси водных растворов белков и моющего средства. 2. Определение протеолитической активности ферментов в моющем сред стве по методу ФОЛП (/2 5.

До начала определения готовят следующие растворы: карбонатный буферный раствор, раствор казеина, раствор трихлрруксуснрй кислоты, раствор натрия углекислого, реактив фолина.

На приготовление растворов используют реактивы тринадцати наименований. Затраты времени на подготовку реактивов 16 ч. Стоимость реактивов на 100 определений 1,15 руб.

Готовят две пробирки. В первую пробирку заливают 2,5 мл дистиллированной вода , во вторую 2,5 мл водного раствора белков. Далее в обе пробирки добавляют 10 мл 2,0%-ного водного раствора моющего средства и выдерживают 2 ч при 50°С. После выдержки добазвляют 5 мл 0,3 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и выдерживают 15 мин при Далее берут две новые пробирки, воронки, фильтровальную бумагу и фильтруют в .течение 1 ч. Во время фильтрования готовят разбавленный раствор фолина. После фильтрования берут еще 2 чистые пробирки, заливают 2 мл фильтрата, 5 мл 0,5 М расвора углекислого натрия и 1 мл рабочего раствора фолина. Смесь выдерживают 30 мин при 50с. После выдержки охлаждают пробирки до 20с в водяной бане в течение 15 мин и измеряют оптическую плотность против контроля при длине волны 630 нм, ширине кюветы 1,0 см на спектрофотометре Specol. Протеолитическую активность вычисляют по формуле ПА 4i2fl i 0ii- . 1000 . (2) п где ПА - протеолитическая активност Д - оптическая плотностьi 4,7 и 0,1 - постоянные коэффициенты п - количество моющего средства, мг, в 2 МП реакционной среды; 1000 - коэффициент.перечета мг в ч 3. Метод Зерейсена-Гаврилова определения растворимого/азота tlj. Готовят две пробирки, и которые заливают по 5 мЛ 5%-ного водного раствора белков. В первую заливают 20 мл дистиллированной воды, а во вторую 20 мл моющего раствора. Оба образца выдерживают 2 ч при . После выдержки добавляют по 2 мл нейтрального формалина и титруют в стакане 0,1 н. NaOH до рН 9,.2. Со держание аминного азота в процентах в пересчете на сухой препарат вычисляют по формуле: у C5V-V.J) .-100-100 ,w, XПоо-wT } где X - содержание амвнмого азота, V - объем 0,1 н. pacTBcJpa NaOH израсходованный на титрование анализа после устано ления нейтргшьной среды; v - объем 0,1 н. раствора NnOH, израсходованный на титрование контрольного образца после установления нейтральной среды, 0,0014 - количество азота, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора NaOH, rj 100 «100- коэффициенты для пересчета в проценты/ С количество раствора белков,. W - содержа,ние воды в растворе белков; %. Результаты сравнения трех методов представлены в табл. 1. По дан11ым табл. 1,установлено, что между протеолитической активностью моющих средств, определенной предпагаемым способом (А), протеолитической активностью моющего средства, определенной по методу ФОЛП (Б), и растворимым азотом, определенным по методу Зерейсена-Гаврилова (В), существует тесная прямая корреляционная зависимость. Определены следуюше коэффициенты : корреляции ДБ 0,9163 достоверность по критерию Стьюдеита 991; АВ 0,6629 достоверносуь 99,9%; БВ 0,7792 достоверность 99,9%. Та блица 1

1. СПОСОБ.ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРрТЕОЛИТИЧЕСКЬй АКТИВНОСТИ МОЩИХ СРЕДСТВ, СОДЕРЖАЩИХ ФЕРМЕН-Ш, С ис пользованием см иения воДного раствора белков с ВОДНЫМ раствсфом моющего Средства, подогрева смеси и выдержки при температуре подогрева , определения оптической плотности исследуемой про( мокздего средства и вычисления протеолятйчёской активности ло Формуле, о т л и ч аю щ и й.с я тем, что, с целью повышения точности, упрсяцения и ускорения, определяют оптическую плотность 0,1-10%-ного ВОДНОГО раствора молочного белка и 0.,1-2 ,.5%-ного ВОДНОГО раствора исследуемой пробы мокйдего средства, смешивают указанньге растворы в объемном соотношении 1:

Раствор молочных белков на воде

Раствор молочных белков на моющем средстве без фермента

Панкреатин медицинский Протосубтилин ГЗХ Протосубтилин Г10Х , . Протогидролитин Трипсин (Датский)

Трипсин кристаллический (ЧССР)

Гликозидаза

0,00

0,00

46,16

13,7 355,2 76,63 298,9 ,72,96 62,29 301,4 152,0 68,84 306,3 75,83

350,3

75,25 32,1 .52,11

Далее проводят испытания предлагаемого .способа при исследовании различных моющих средств. Кроме того г изменяют различные параметры проведения опыта с целью определения границ его применения.

В табл. 2 представлен результаты исследований.

Таблица 2

Проведенные исследования показали , что предлагаемый способ являет ся чувствительным при указанных параметрах определения, при этсм )жнр. применять различные белковые продукты молочного происхождения. В табл.2 каждук) серию опытов следует рассматривать раздельно. Из табл. 2 видно, что протеолитическая активность моющих средств в большей степени проявляетвя на сухом и сгущенном обезжиренном молоке , в котором основное количество белков составляет казеин. Температура, время вьвдержки и другие

Продолжение таОл. 2

парамет ш возможно менять с целью сокращения длительности определения. Оптимальным является использование сывороточных белков молока, при55 менение 5%-ного водного раствора белков, разбавление четырехкратным количеством перед определением оптической плотности, определение оптической плотности при длине волны

60 3 600 им. Другие параметры следует стандартизировать в зависимости от целей определения.

Длительность одного анализа при 65 осуществлении предлагаемого спосо13106574214

ва 2 ч.30 мян. По методу ФОЛП дли-личеством операций и исключением

тельность одного анализа 5 ч 15 мин.операций, требующих субъективного Таким образом, использование пред- .определения, требует меньше мателагаемого способа определения про-риальных затрат, при этсад сокращатеолитической активности моющих ется продолжительность определения

средств по сравнению с известными в результате отсутствия операций

способами позволяет повысить точностьподготовки химреактивов, фильтроваопредеяенйя в связи с меньшим ко- ния и повторного теркюста ирования.