Способ получения текстильного материала с иммобилизованными ферментами Советский патент 1993 года по МПК A61L15/16 C12N11/18 

Изобретение относится к химической технологии, конкретно к способу иммобилизации ферментов на текстильных материалах, и может быть использовано в медицине .при получении перевязочных материалов с биологической активностью.

Цель изобретения - получение полиферментного материала с высокой ферментативной активностью и снижение расхода фермента.

Поставленная цель достигается тем, что .в способе получения текстильного материала с иммобилизованными ферментами, включающем гидролиз поликапроам идного материала 2-3 N раствором гидроокиси натрия или калия и обработку раствором фермента; в качестве раствора для обработки используют смесь растворов различных ферментов и желатины, модифицированной

глутаровым альдегидом при массовом соотношении фермента, желатины и глутарового альдегида (0,2-1,0):(2,0-2,5):(0,05-0-1), а обработку проводят до массового соотношения материала и каждого фермента 1000:(0,4-1,7).

Раствор фермента с желатиной, модифицированной глутаровым альдегидом, готовят для каждого фермента в отдельности.

Пример.. Поликапроамидный текстильный материал в виде трикотажного по- лотна ластичного переплетения 1x1 обрабатывают 2N водным раствором гидроокиси калия при комнатной температуре в течение 20 ч при модуле б. Отмывают дистиллированной водой до рН 7 промывных вод и сушат на воздухе.

do

со ел

Растворы ферментов для обработки текстильного материала готовят следующим образом:

4 г желатины заливают 100 мл дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения. Параллельно готовят 100 мл 0,2%-ного раствора глутарового альдегида в карбонатной буфере с рН 9. Растворы желатины и глутэрового альдегида смешивают в объемном соотношении 1:1 и оставляют на 20 мин в темном месте при комнатной температуре. .. ;; : . .

0,5 г коллитина растворяют в 500 мл фосфатного буфера с рН4Д получают 0,1 %- ный раствор коллитина. 1 г лизоцима растворяют в 500 мл фосфатного буфера с рН 7, получают 0,2%-ный раствор лизоцима.

К 100 мл раствора смеси желатины с глутаровым альдегидом добавляют 500 мл 0,1%-ного раствора холлитина. Массовое соотношение желатинькглутаровый альдегид: фермент-2:0,1:0,5. Костальным 100мл смеси желатины с глутаровым альдегидом добавляют 500 мл 0,2%-ного раствора лизоцима. Массовое соотношение желатины; глутаровый альдегид:фермент - 2:0,1:1. Объемное соотношение раствора желатины, модифицированной глутаровым альдегидом и ферментов (каждого в отдельности) выражается значением 1:5. Смеси выдерживают в темном месте при комнатной температуре в течение 15 мин (в отдельных емкостях), затем объединяют, перемешивают и объединеннуюсмесь помещают поликапроамидный материал - на 1 мае.ч. материала 2 части жидкости. Материал смешивают с жидкостью до полного ее поглощения и отжимают до привеса - 190%. Затем сушат на воздухе. Получают материал, содержащий коллитин м лизоцим при массовом соотношении материала, колли- тина и лизоцима 1000:0,8:1,7. Бактериоли- тическая активность материала составляет 248,0 ед.г, протеолитическая активность - 0,53 ПЕ/г коллагенолитическая активность 17,0 мг-экв,лейцина/г носителя.

Пример 2. Обработку текстильного поликапроамидного материала проводят 3N водным раствором гидроокиси натрия по примеру 1.

7,5 г желатины заливают 150 мл дистиллированной воды и раствор готовят по примеру 1. . ..

0,1 %-ный раствор глутарового альдегида в количестве 150 мл готовят по примеру 1. . . .

Растворы желатины и глутарового альдегида смешивают при их объемном соотношении 1:1, оставляют на 2Q мин в темном .месте при комнатной температуре.

0,5 г трипсина растворяют в 500 мл фосфатного буфера с рН 6, получают 0,1 %-ный раствор трипсина. 1 г лизоцима растворяют в 500 мл фосфатного буфера с рН 7, получают 0,2%-ный раствор лизоцима. 0,5т колла- геназы растворяют в 500 мл фосфатного буфера с рН 7, получают 0,1 %-ный раствор коллагеназы. .

Получение растворов ферментов для обработки материала и обработку материала проводят по примеру 1, Массовое соотношение желатина :глутаровь1й альдегид: фермент для трипсина - 2,5:0,05:0,5; для лизоцима - 2,5:0,05:1; для коллагеназы 2,5:0,05:0,5. Получают материал, содержащий трипсин, лизоцим и коллагеназу при массовом соотношении материала, трипсина, лизоцима и коллагеназы - 1000:0.6:1,2:0,6. ,;.,;-; , / . .

П Ьтеолитическая активность материал ла составляет 0,58 ПЕ/г, бактериолитиче- ская активность .-... 255 ед./г, коллагенолитическая активность - 12 мгэкв.лейцина/г.;;, :;; : :

п р и мер 3. Обработку материала, проводят гидроокисью натрия, получение растворов желатины и глутарового альдегида проводят как в примере Т. ... , 0,4 г растворяют в 400 мл буферного

раствора с рН 4,8 (фосфатный буфер), получают 0,1 %-ный раствор коллитина 0,4.г лизоцима растворяют в 400 мл фосфатного буфера с рН 7, получают 0,1 %-ный раствор

.ЛИЗОЦИМа/- .-. V- :. ;..: . .-. ... - . ; .-, :.. . ;

к 100 мл раствора смеси желатины с глутаровым альдегидом добавляют 400 мл 0,1 %-ного раствора коллитина. К остальным 100 мл раствора смеси желатины с глутаровым альдегидом добавляют 400 мл 0,1 %-ного раствора. лизоцима. Массовое соотношение Желатина: глутаровый альде- гид:фермент для коллатина 2:0,1:0,4; для лизоцима - 2:0,1:0,4. Далее обработку проводят по примеру 1. Получают материал,

содержащий коллитин и лизоцим при массовом соотношении материала, коллитина и лизоцима 1000:0,8:0,8.. .

Протеолитическая активность материа- ла 0,35 ПЕ/г, бактериолиТическая активность 131 ед./г, коллагенолитическая - 12,8 мг-экв.лейцина/г носителя.

Пример 4. Обработку материала проводят гидроокисью натрия, получение растворов желатины и глутаров.ого альдегида проводят как в примере 1.

0,1 г трипсина растворяют в 400 мл буферного растврра.с рН б, (фосфатный буфер), получают 0,05%-ный раствор трипсина. 0,4 г лизоцима растворяют в 400

мл фосфатного буфера с рН 7, получают 0,1 %-ный раствор лизоцима.

К 100 мл раствора смеси желатины с глутаровым альдегидом добавляют 400 мл 0,05-ного раствора трипсина. К остальны .- м 100 мл раствора смеси желатины с глутаровым альдегидом добавляют .400 мл раствора лизоцима. Массовое соотношение желатины, глутарового альдегида и фермента для трипсина 2:0,1:0,2; для лизоцимы - 2:0,1:0,4. Далее обработку производят по примеру 1. Получают материал, содержащий трипсин и лизоцим при массовом соотношении материала,трипсина и лизоцима - 1000:0.4:0,8.

Претеолитическая активность препарата 0,55 ПЕ/г, бактериолитическая активность 188,0 ед./г.

Для определения протеолитической активности используют стандартный метод для комплексных препаратов протеинов.

Реактивы:

1. Фосфорный буфер 1/15 М, рН 8.

2.0,34 N NaOH.

3. Трихлоруксусная кислота 10%-ная (ТХУ).

4. Казеин 2 %-ный. (раствор в фосфорном буфере 1/15 М рН 8)

Проведение анализа: Навеску иммобилизованного материала помещают в прб- бирку (0,0500-0,3000. г, точная навеска); прибавляют2,5 мл фосфатного буфера(1 /15

М рН 8) и ставят в термостат при 37° на 10 мин. Добавляют в пробирку по 2,5 мл раствора казеина 2%-ного в фосфатном буфере 1/15 М рН 8 и оставляют при 37°С на 1 ч. После термостатирования содержимое пробирок смешивают с 5 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и оставляют на 10 мин..

Содержимое пробирок фильтруют и из каждого фильтрата отбирают в чистые пробирки по 2.мл. Затем к фильтрату приливают по 2 мл. 0, N NaOH.

Измеряют оптическую плотность против контроля при 200 нм.

Контрольная проба - навеска носителя без иммобилизованного фермента, по массе соответствующая массе испытуемой пробы + 2.5 мл казеина + 2,5 мл фосфатного буфера + 5 мл 10%-ного раствора ТХУ. Отбирают по 2 мл фильтрата также, как в испытуемой пробе, после чего к ним приливают по 2 мл 0,34 NaOH.

Активность определяют по формуле ДР-20МЛ (мкмол /г).

А Кт-Ш(мин.г) где D - разница между D образца и D контрольной пробы,

20 - разведение, 60 - время (мин), - вес (г),

Кт - коэффициент тирозиновый (1,52 5 мл/мкмоль).

Определение коллагенолитической активности иммобилизованного фермента. Реактивы:

1. Трис-буфер 0,1 М рН 4Ч. 0 2. Нингидриновзя смесь - 4%-ный раствор нингидрина в метилцелозольве. 3. Цитратный буфер 0,2 М рН 5,1. 4. Хлорид олова - 0,0801 г в 50 мл цитатного буфера 0,2%-ного, рН 5,1 (хранить в 5 темной склянке).

За 1 ч до определения раствор хлорида олова смешать с раствором нингидрина в метилцелозольве в темной склянке.

5. Раствор коллагена 12%-ный в трис- 0 буфере (рН 4).

Готовится накануне. За 1 сутки растворить коллаген в трис-буфере и довести его рН до 7 с помощью 1N NaOH, поставить на холод. Утром разогреть на магнитной ме- 5 щалке и довести рН до 7,5.

6 Раствор эталона 50%-ный. Проведение анализа. Взять навески образцов 0,05-0,10 г)-точная навеска.К навескам добавить 2,5 мл трис-буфера и 2,5 мл 0 раствора коллагена, в котором 5,0 мл трис. Помещаем в термостат при 37°С на встряхи- вателе на 5 ч.

За 30 мин до окончания экспозиции в чистые пробирки помещают по 1 мл нингид- 5 «риновой смеси. В пробирку для установки - 2 мл. К нингидриновой смеси добавляем по 0,2 мл инкубированного раствора, а в пробирку для установки нуля - 0,4 мл. Помещаем полученную смесь в кипящую водяную 0 баню (100°С), пробирки прикрепить резинками), на 20 мин. По истечении 20 мин пробирки охладить в холодной воде и добавить,, в каждую по 5 мл 50%-ного эталона, а в пробирку для установки нуля - 10 мл. 5 Измеряем оптическую плотность при 570 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Активность рассчитываем по формуле с использованием калибровочной кривой по лейцину:. 0 А.- .

ДР-5 (мкмоль.экв. лейцина/мг препарата)

вес навески

В качестве контроля через всю методику проводится образец носителя без иммоби- 5 лизованного фермента.

Определение активности лизоцима, иммобилизованного на текстильных материалах, проводят по турбидиметрической методике. ,

Турбидиметрический метод .определеия активности лизоцима основан на специическом ферментативном лизисе изоцимом эталонного штамма. Об активости лизоцима судим по изменению степеи пропускания..

Реактивы:

Фосфатный буфер 1/15 М рН 6,2±0,05 NaCI.

Клеточная суспензия M-icrococcus lysodeikticus 15 мг в 100 мл буфера.

(Химическую посуду, используемую для пределения активности лизоцима, нельзя мыть детергентами, т.к. они ингибируютли- зоцим).

Навески материала 5 мг, 10 мг и 15 мг или 10 мг, 15 мг и 25 мг и т.д. в зависимости т активности испытуемого материала. В каестве контроля используется носитель без иммобилизованного фермента.

Клеточная суспензия Micrococcus lysodeikticus приготовляется путем встряхивания навески культуры с буферным раствором в течение не менее 30 мин.

Взвешенные образцы помещают в конические колбы емкостью 20 мл с притертыми пробками, добавляют в них по 10 мл клеточной суспензии и помещают в термостат п ри постоянном помешивании на встряхивателе при 37°С на 45 мин.

Затем измеряют пропускание Т (О) на Specol при длине волны 640 им в кювете с толщиной слоя 5 см против воды. Из Т образца вычитают Т контрольной пробы.

Расчет активности проводятс использованием стандартной кривой, построенной для кристаллического лизоцима.

Т по кривой соответствует расчет по формуле:

С-10-1000 .

яж где С/20 - содержание лизоцима в мкг/мл измеряемой пробе,

10 - объем жидкости в кювете,

В - масса образца,

1000 - перерасчет на г.

1 ед. активности лизоцима равна уменьшению оптической плотности раствора на 1% в минуту в пересчете на 1 г лизоцима, взятого для определения.

Медицинский лизоцим в количестве 2,5 мкг изменяет Т на 27,5 % за 45 мин. Примечание.

1. Т клеточной взвеси должно быть 6- 8%.

2. При изготовлении суспензии клеточной взвеси перемешивание надо производить сразу же после взятия навески и помещения ее в буферный раствор во избежание склеивания бактериальных клеток.

Использование раствора желатины более низкой концентрации не представляется, возможным, т.к. эти растворы обладают слишком малой вязкостью, и при высушивании сливаютеяс носителя вместе с иммобилизованными на желатине ферментами.

Более высокая концентрация растворов желатины не может быть применена потому, что эти смеси теряют подвижность и не мо- гут быть использованы для смачивания носителя, поскольку не являются жидкостью, Преимущества предлагаемого способа перед известным представлены в таблице. Как видно из таблицы, при использовании предлагаемого способа можно получить полиферментный материал с 2-3 видами специфической активности, при этом проте- олитическая активность материала в 2-2,4 раза выше, чем в материале, получаем по

известному способу, а расход фермента на получение I ПЕ.снижен примерно в 25-60 раз.,.:

Формула изобретения Способ получения текстильного материала с иммобилизованными ферментами, включающий гидролиз поликапроамидного текстильного материала 2-3 н водным раствором гидроокиси натрия или калия и обработку раствором фермента, отличаю щ ии с я тем, что, с целью получения полиферментного материала с высокой ферментативной активностью и снижения расхода фермента, сначала готовят растворы различных ферментов и желатины, модифицированной глутаровым альдегидом при массовом соотношении фермента, желатины и глутарового альдегида (0,2-1,0):(2,0- 2,5):(0,05-0,1), а иммобилизацию проводят до массового соотношения текстильного материала и каждого фермента 1000:(0,4-Т,7).

Продолжение табл.

Использование: в химической технологии именно при иммобилизации ферментов на текстильных материалах для применения в медицине при получении перевязочных материалов с биологической активностью. Сущность изобретения: текстильный поликапроамидный материал гидролизуют 2-3 N водным раствором гидроокиси натрия или калия и обрабатывают смесью растворов различных ферментов и желатины, модифицированной глутаровым альдегидом при массовом соотношении фермента, желатины и глутарового альдегида (0,2-1.0):(2,0-2,5):(0,05-0,1) до. массового соотношения текстильного материала и каждого фермента 1000:(0,4-Т,7). Раствор фермента с желатиной, модифицированной глутаровым альдегидом, готовят для каждого фермента в отдельности. Положительный эффект; снижается расход ферментов и достигается высокая ферментативная активность. 1 табл. ел С

Критерии оценки

оличество трипсина , необходимое для получения в материале 1 ПЕ, мг Бактериолитйческая

активность, ед./г Массовое соотношение

ферменгнреитель

Коллагенолитическая

акт. мг-экв. лейцина/г

Массовое соотношение

фермент:носитель

Способ получения материала

Предлагаемый

Известный

29-44