Способ определения протеолитической активности бактерий в биологических объектах Советский патент 1985 года по МПК G01N33/04 

I

Изобретение относится к молочной промьшленности и может быть использовано для определения протеолитической активности молочнокислых бактерий по тирозину.

Известен способ определения протеолитической активности бактерий в биологических объектах, предусматривающий осаждение белков путем добавления в исследуемый образец раствора трихлоруксусной кислоты, .выдержкуj отделение белка от фильтрата фильтрованием, проведение цветной реакции путем добавления фенольного реактива и щелочи к фильтрату, определение оптической плотности фильтрата и протеодитической активности по количеству тирозина lj . Недостаток известного способа в том, что он не обеспечивает достаточной точности определения протеоглитической активности в молочных средах, так как в этих средах содержится значительно больше нерасщепленных белков, которые являются балластом в исследуемом растворе и затрудняют количественное определение тирозина.

Цель изобретения - повьшение точности определения.

Поставленная цель достигается тем, что со.гласно способу, предусматривающему осаждение белков путем добавления в исследуемый образец раствора трихлоруксусной кислоты, вьщержку, отделение белка от фильтрата фильтрованием, проведение цветной реакции путем добавления фенольного реактива и щелочи к фильтрату, определение оптической плотности фильтрата и протеолитической активности по количеству тирозина, осаждения белков осуществляют 12%-Hbw раствором трихлоруксусной кислоты с последующим охлаждением, выдержку осуществляют в течение 20 мин при 0-2с для проведения .цветной реакции фенольный реактив и щелочь добавляют к 1-3 мл фильтрата, причем перед определением оптической плотности фильтрат фильтруют, а количество тирозина рассчитьшают по формуле

п

мг %,

X

10

где X - содержание тирозина в 1 мл исследуемого образца;

505342

b - содержание тирозина в 1 мл фильтрата с трнхлоуксусной (ТХУ) кислотой, ; а - количество (мл) фильтрата с 5 трихлоруксусной кислотой,

взятого Б колбочку на 50 мл; п - кратность разведения образца с трихлоруксусной кислотой, 1/10 - перевод из у в мг %. Кроме того, при исследовании .продуктов с вязкой консистенцией отделение белка от фильтрата осуществляют центрифугированием,

В связи с тем, что в молоке и кисломолочных продуктах содержится повышенное количество белка в среднем до 3%, то для его осаждения при определении, свободных аминокислот по тирозину в молочных образцах берут повьшенную концентрацию трихлоруксусной кислоты 12% вместо 4% по прототипу.

С целью повышения точности анализа более полного осаждения белка, введено увеличение выдержки .образцов с трихлоруксусной кислотой до 20 мин вместо 15 мин, вызвано снижением температуры охлаждения образцов с комнатной температуры до 0-2°С,.поскольку последняя снимает отрицательное действие повьшенного количества трихлоруксусной кислоты на образец.

Пример 1. Берут 10 мл исследуемого образца, добавляют 5 мл 12%-ной трихлоруксусной кислоты, взбалтывают, охлаждают водой со льдом до , в течение 20 мин выдерживают при этой температуре, затемфильтруют через бумажный складчатый фильтр. Для выявления аминокислот триптофана, пистеина, тирозина, используют цветную реакцию с фенольным реактивом, разведенным дистиллированной водой в соотношении 1:2.

Для осуществления цветной реакции берут 3 МП исследуемого фильтрата в мерную колбу на 50 мл, добавляют к нему 10 мл раствора NaOH, 3 мл водного раствора фенольного резитива

0 и дистиллированную воду до метки, тщательно взбалтьюают и после установления цветной реакции фильтруют. Через 5 мин определяют оптическую плотность. В данном случае оптическая плотность составляет 0,26, что соответствует 110 Y чистого тирозина на стандартной кривой. Подстановка исходных данных в формулу расчета позволила определить количество тирозина, цистеина, триптофана в .пересчете на тирозин в 1 мл исследу мого образца - 5,5 .мг% 110 10 . 3 Метод точен, так как по нему определяется количество свободных аминокислот по- стандартной кривой, построенной по растворам с известным содержанием химически чистого тирозина. Процент ошибки в зоне точ ности не превышает 2,5-5%, что приемлемо для исследования биологических объектов. Пример 2. Берут 10 мл исследуемого вязкого образца, добавляют 5 мл 12%-ной трихлоруксусн кислоты, охлаждают до 2 С, в течение 20 мин вьщерживают при этой температуре, отделяют белок центрифугированием, 2 МП Фильтрата вносят в мерную колбочку на 50 мл, добавляют 10 мл 1/2 н. раствора NaOH 3 мл фенольного реактива и доливаю дистиллированную воду до метки, взбалтывают, фильтруют, и через 10 мин определяют на ФЭКе. Оптическая плотность составляет 0,15 , что соотв ствует 1 16 I на стандартной кривой , 344 Подстановка исходных данных в формулу пересчета позволила определить количество тирозина, пистина, триптофена в пересчете на тирозин в 1 мл исследуемого образца Ь5 о 7 - о, / 10 . 3 П р и м е р 3. Берут 10 мл исследуемого образца, добавляют 5 мл 12%-ной трихлоруксусной кислоты, охлаждают до , в течение 20 мин отделяют белок через бумажный фильтр, 1 мл фильтрата вносят в колбочку на 50 мл, добавляют 10 мл 1/2 н. раствора NaOH 3 мл фенольного реактива и доливают дистиллированную воду до метки, взбалтьшают, фильтруют и через 10 мин определяют на ФЭКе, Оптическая плотность соответствует 0,12, что составляет 106 у на стандартной кривой. Подстановка исходных данных в расчетную формулу 106 . 1,5 ., - „ 15,9 мг% позволяет определить аминокислоты в 1 мл исследуемого образца с точностью 95-98%.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ, предусмат1ривак щий осаждение белков путем добавления в исследуемый образец раствора трихлоруксусной кислоты, вцдержку, отделение белка от фильтрата фильтрованием, проведение цветной реакции путем добавления фёнольного реактива и щелочи к фильтрату, определение оптической плотности фильтрата и протеолитической активности по количеству тирозина, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, осаждения белков осуществig..::io:...v ляют 12%-ным раствором трихлоруксусной кислоты с последующим охлаждением, выдержку осуществляют, в течение 20 мин при 0-2 С, для проведения цветной реакции фенольный реактив и щелочь добавляют к 1-3 мл фильтрата, причем перед определением оптической плотности фильтрат фильтруют, а количество тирозина рассчитывают по формуле мг%. X Ю-а где X - содержание тирозина в 1 мл исследуемого образца; , b содержание тирозина в 1 мл фильтрата с трихлоруксусной (Л кислотой, V ; количество фильтрата (мл) а с трихлоруксусной кислотой, взятого в колбочку на 50 мл; кратность разведения образца п с трихлоруксусной кислотой, 1/10 - перевод из V в мг%. 2. Способ ПОП.1, отлича ю- щ и и с я тем, что при исследоваел U1 нии продуктов с вязкой консистенцией отделение белка от фильтрата осуществляют центрифугированием. &9 4i