СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКОГО АДСОРБЕНТА Советский патент 1998 года по МПК B01J20/04 A61K31/725 

Способ может быть использован в медицине для удаления из крови и других биологических жидкостей вредных примесей, например холестерина и/или других связывающихся с гепарином соединений.

Известно использование в качестве адсорбента для удаления из крови холестерина пористого стекла [1]
Недостатками этого адсорбента являются неспецифичность адсорбции (на пористом стекле удаляются и другие компоненты крови) и повышенный гемолиз крови при ее контакте с адсорбентом.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к описываемому является способ получения биоспецифического адсорбента, включающий ковалентную иммобилизацию гепарина с гидрофильным полимером [2]
По данному способу ковалентную иммобилизацию гепарина проводят активацией агарозы бромцианом с последующей реакцией активированной агарозы с раствором гепарина. Удаление холестерина и других связывающихся с гепарином соединений, например триглицеридов, фосфолипидов и тому подобное, проводят путем инкубирования крови с адсорбентом или путем пропускания крови через адсорбент, к которому предварительно добавляют CaCl₂ в концентрации 0,02 моль/л. Емкость такого адсорбента по холестерину и триглицеридам при извлечении их из крови составляет 2,5-2,9 мг/г сорбента.

Недостатком данного способа является то, что полученные по нему адсорбенты обладают невысокой емкостью и стабильностью, а также использование при синтезе отравляющего вещества бромциана.

Целью изобретения является синтез биоспецифического адсорбента, обладающего повышенной емкостью по отношению к холестерину и другим связывающимся с гепарином соединениям.

Цель достигается описываемым способом получения биоспецифического адсорбента, включающим ковалентную иммобилизацию гепарина с гидрофильным полимером путем ацилирования гепарина хлорангидридом ненасыщенной кислоты и последующей его сополимеризацией с ненасыщенным мономером в присутствии сшивающего агента.

Ацилирование ведут при pH 6,0-8,0, температуре 0-30^oC и мольном соотношении гепарин хлорангидрид ненасыщенной кислоты, равном 1 10-50. В качестве ненасыщенных мономеров используют акриламид, оксиэтилметакрилат, N - винилпирролидон и другие при их весовом отношении к ацилированному гепарину, равном 25 90 10 -25.

В качестве сшивающего агента используют N, N -метиленбисакриламид, диэфиры акриловой или метакриловой кислоты, а также ацилированный гепарин, содержащий две и больше двойных связей в молекуле, при его весовом отношении к гидрофильному мономеру, равном 5-50:50-95.

Технология способа заключается в следующем. Сначала проводят ацилирование гепарина хлорангидридом ненасыщенной кислоты, например акриловой или метакриловой, при pH 6,0-8,0 и температуре 0-30^oC путем добавления к водному раствору гепарина хлорангидрида в количестве 10-50 моль на 1 моль гепарина. Сополимеризацию ацилированного гепарина с ненасыщенным гидрофильным мономером проводят под действием инициатора радикальной полимеризации, например рибофлавина, УФ облучения смеси персульфата с N, N, N, N -тетераметилэтилендиамином и тому подобными при 0-30^oC. В качестве ненасыщенного гидрофильного мономера используют водорастворимые мономеры, например акриламид, оксиэтилметакрилат, N винилпирролидон и т.п. Весовое соотношение ацилированный гепарин ненасыщенный гидрофильный мономер составляет при этом 10 25 25 90. Весовое соотношение ненасыщенный гидрофильный мономер сшивающий агент равно 5 50 50 -95. В качестве сшивающего агента используют N, N метиленбисакриаламид, диэфиры акриловой или метакриловой кислоты, а также ацилированный гепарин, содержащий две и больше двойных связей в молекуле.

Удаление холестерина и других соединений из крови и других биологических жидкостей проводят путем инкубирования жидкости с адсорбентом или путем пропускания жидкости через колонку, заполненную адсорбентом. Предварительно к адсорбенту добавляют CaCl₂ в количестве 0,02 моль/л.

Пример 1. К 100 мл бикарбонатного буфера (pH 8,0), содержащего 7,5 г гепарина, добавляют при 0^oC 0,45 г хлорангидрида акриловой кислоты (мольное соотношение гепарин:хлорангидрид равно 1:10). Раствор перемешивают 15 мин и к нему добавляют 7 г акриламида и 0,7 г N, N метиленбисакриламида. Полимеризацию проводят при 0^oC, используя в качестве инициатора смесь персульфата аммония и N, N, N, N -тетраметилэтилендиамина. После окончания полимеризации (1 ч) адсорбент измельчают и промывают физиологическим раствором.

Пример 2. К 100 мл фосфатного буфера (pH 6,0), содержащего 20 г гепарина, добавляют при 30^oC 6 мл хлорангидрида акриловой кислоты. Раствор перемешивают 1 ч и к нему добавляют 7 г акриламида и 0,7 г N, N - метиленбисакриламида. Полимеризацию проводят, облучая раствор видимым светом, используя в качестве инициатора рибофлавин, концентрация которого составляет 10 мг/л. Затем адсорбент обрабатывают по примеру 1.

Пример 3. К 100 мл фосфатного буфера (pH 7,0), содержащего 5 г гепарина, добавляют 0,3 г хлорангидрида метакриловой кислоты при 20^oC. Раствор перемешивают 20 мин и к нему добавляют 50 г акриламида и 2,5 г N,N -метиленбисакриламида. Полимеризацию проводят при 20^oC, используя смесь персульфата аммония и N, N, N, N тетраметилэтилендиамина в качестве инициатора. Далее адсорбент обрабатывают по примеру 1.

Пример 4. К 100 мл фосфатного буфера (pH 7,0), содержащего 20 г гепарина, добавляют 2 г хлорангидрида метакриловой кислоты при 20^oC. Раствор перемешивают 50 мин и к нему добавляют 80 г акриламида. Полимеризацию и обработку проводят по примеру 1.

Пример 5. К 100 мл бикарбонатного буфера (pH 8,0), содержащего 5 г гепарина, добавляют при 20^oC 0,9 г хлорангидрида метакриловой кислоты. Раствор перемешивают 20 мин и к нему добавляют 20 г акриламида и 1,7 г N,N - метиленбисакриламида. Полимеризацию и обработку проводят по примеру 1.

Пример 6. К 100 мл бикарбонатного буфера (pH 8,0), содержащего 20 г гепарина, добавляют 3 г хлорангидрида акриловой кислоты при 20^oC. Раствор перемешивают 50 мин и к нему добавляют 20 г акриламида и 1,8 г N,N - метиленбисакриламида. Полимеризацию и обработку проводят по примеру 1.

Пример 7. Ацилирование, полимеризацию и обработку проводят по примеру 6, используя 20 г гепарина, 3 г хлорангидрида акриловой кислоты, 20 г N - винилпирролидона и 2,0 г N,N метиленбисакриламида.

Пример 8.

К 100 мл бикарбонатного буфера (pH 8,0), содержащего 20 г гепарина, добавляют 3 г хлорангидрида акриловой кислоты при 20^oC. Раствор перемешивают 50 мин и к нему добавляют 20 г N винилпирролидона и 20 г диэфира метакриловой кислоты и полиоксиэтиленгликоля со степенью полимеризации 13. Полимеризацию проводят, облучая раствор УФ-излучением в течение 3 ч при 20^oC. Адсорбент обрабатывают по примеру 1.

Пример 9. К 100 мл бикарбонатного буфера (pH 8,0), содержащего 15 г гепарина, добавляют 2 г хлорангидрида акриловой кислоты при 20^oC. Раствор перемешивают 40 мин и к нему добавляют 20 г оксиэтилметакрилата и 2 г N, N -метиленбисакриламида. Полимеризацию и обработку проводят по примеру 1.

Проводят изучение адсорбционных свойств синтезированных адсорбентов путем инкубирования определенного количества крови, плазмы или сыворотки с адсорбентом, содержащим 0,02 моль/л CaCl₂. Инкубирование ведут в стеклянной пробирке в течение 10-15 мин. Свойства адсорбентов, полученных по примерам 3, 6 и 8, изучают путем пропускания жидкости через колонку, содержащую определенное количество адсорбента. Колонку изготовляют из полиметилметакрилата и силиконизируют для повышения гемосовместимости. С двух сторон колонки помещают фильтры диаметром 0,2 мм, изготовленные из капрона. В аналогичных условиях исследуют адсорбционные свойства поглотителя, полученного по способу-прототипу. Свойства всех синтезированных адсорбентов приведены в таблице.

Как видно из таблицы, предлагаемый адсорбент обладает рядом преимуществ по сравнению с известным. Замена природного полимера агарозы синтетическим гидрофильным полимером в значительной степени увеличивает стабильность адсорбента. Предлагаемый адсорбент обладает более высокой емкостью по сравнению с известным. Так, обработка 5 мл крови или 3 мл плазмы 3 г адсорбента-прототипа позволяет снизить концентрацию холестерина с 231 и 221 до 84 и 73 мг% соответственно. Использование таких же количеств предлагаемого адсорбента позволяет снизить концентрацию холестерина в крови и плазме с 192 и 211 до 34 и 47 мг% соответственно. Увеличение емкости адсорбента позволит более эффективно проводить адсорбцию холестерина и других соединений из крови и других биологических жидкостей без существенного разбавления этих жидкостей физиологическим раствором.

1. Способ получения биоспецифического адсорбента, включающий ковалентную иммобилизацию гепарина с гидрофильным полимером, отличающийся тем, что, с целью повышения емкости адсорбента по отношению к холестерину и другим связывающимся с гепарином соединениям, иммобилизацию ведут путем ацилирования гепарина хлорангидридом ненасыщенной кислоты и последующей его сополимеризации с ненасыщенным мономером в присутствии сшивающего агента.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что ацилирование ведут при pH 6,0-8,0, 30^oС и молярном соотношении гепарин : хлорангидрид ненасыщенной кислоты 1 : 10 - 50.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве ненасыщенных мономеров используют акриламид, оксиэтилметакрилат, N-винилпирролидон при их массовом соотношении с ацилированным гепарином 25 - 90 : 10-25.

4. Способ по пп. 1 - 3, отличающийся тем, что в качестве сшивающего агента используют N,N-метиленбисакриламид, диэфиры акриловой или метакриловой кислоты, а также ацилированный гепарин, содержащий две и больше двойных связей в молекуле, при его массовом соотношении с гидрофильным мономером 5 - 50 : 50 - 95.

1. Способ получения биоспецифического адсорбента, включающий ковалентную иммобилизацию гепарина с гидрофильным полимером, отличающийся тем, что, с целью повышения емкости адсорбента по отношению к холестерину и другим связывающимся с гепарином соединениям, иммобилизацию ведут путем ацилирования гепарина хлорангидридом ненасыщенной кислоты и последующей его сополимеризацией с ненасыщенным мономером в присутствии сшивающего агента. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что ацилирование ведут при pH 6 8, 0 30^oС и молярном соотношении гепарин хлорангидрид ненасыщенной кислоты 1 10 50. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что в качестве ненасыщенных мономеров используют акриламид, оксиэтилметакрилат, N-винилпирролидон при их массовом соотношении с ацилированным гепарином 25 90 10-25. 4. Способ по пп.1 3, отличающийся тем, что в качестве сшивающего агента используют N,N-метиленбисакриламид, диэфиры акриловой или метакриловой кислоты, а также ацилированный гепарин, содержащий две и больше двойных связи в молекуле, при его массовом отношении с гидрофильным мономером 5 50 50 - 95.