Способ получения тромборезистентных полимерных материалов Советский патент 1979 года по МПК C07G7/02 C08F12/08 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБОРЕЗИСТЕНТНЫХ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ рение шва между искусственным и естественным органом под действием этого фермента. Цель изобретения - повышение тромборезистентной и ({ибринолитической активности и стабильности полимерного материала. Это достигается Sa счет химической им- мобилизапии на поверхности предварител ьн озонированного полимерного материала, ац лированного ангидридом или хлорангилридом акриловой или метакриловой кислоты фибринолитического фермента микробного происхождения, выделенного из Actinomvces r/)i(eroides,mT. i ИммоОализациго проводят в присутствии ненасыщенного гидрофильного мономера под действием инициатора радикальной полимеризации. Реакцию озонирования полимерного м териала проводят обычным образом при О-1ОО С пропусканием над поверхностью обезжиренного материала озона со скоростью 3-7 л/ч. Реакцию .иммоби зации фермента на поверхность озониров ного полимера проводят растворением адили.рованного фермента обычно в буфер ном растворе (рН 7,0-9,0) до концентрации 0,5-10 мг/мя с пЬспедующим растворением в том же растворе гидрофильного мономера до концентрации 1-500 мг/мл, погружением в полученны раствор озонированного полимера и воздействием на реакционную смесь инициа тором радикальной полимеризации. Реакцию иммобилизации проводят предпочтительно при С. в вакууме или в атмосфере инертного газа, например аргона или азота. Весовое соотношение ацилированный фермент : гидрофильный мономер 1:50-800. В качестве исходного полимерного материала используют полиэтилен, полипропилен, полистирол, пол метилметакрилат, сложные полиэфиры и т.п в качестве гидрофильного мономера - ак риламид, метакриламид, оксиэтилметакри лат и т.д., а в качестве инициатора полимеризации вещественные инициаторы, например динитрил бисазоизомасляной кислоты и рибофлавин, а также УФ-излу- чение, Адйлированный фермент получают, добавляя к раствору фермента с ко1щенрат цйей 0,5-1О мг/мл ангидрид или хлорангифид акриловой или метакрнловой кислоты обычно при рН 7,0 - 9,0, тем.пературе О-60 С и мольном соот юшеш1 ферментгангндрид или хлорангитэид I-IO500. Основной отличительный признак изо&« ретения - используемый фибринолитическйй фермент., Условия проведения проиесса иммоа1лизации фермента (рН, температура и соотношения реагентов) полностью ;)бусловленьг /физико-химический и биологической природой самого фермента и полимерного носителя, и могут изменяться в довольно широких пределах. Пример 1. Ацйлирование фермента проводят при О С добавлением к раствору 50 мг фермента в 50 мл би- . карбонатного буфера (рН 8,0) 0,05 г клорангидрида акриловой кислоты. Затем перемешивают в теченке 15 мин и к раствору добавляют 4 г зкркламида. Озонирование полипропиленовой пленки толщиной 0,05 мм и площадью 10 см проводят при 2О С, пропуская над поверхностью обезжиренной диэтиловым эфиром пленки озона со скоростью 7 л/ч в течение 4 4,1 Озонированную пленку помещают в раствор ацилированного фермента и акриламида. Раствор вакуумируют до 10 мм рт,ст. и облучают УФ светом в течение 2 ч.. Облученную пленку промывают бикарбонатным буфером. Активность полученной пленки при использовании в качестве субстрата 1%-ного раствора казеина 9,3tO,2 мкг тирозина/мин. При внесении пленки на поверхность сформировавшегося сгустка фибрина зона растворимости образуется в течение 8 мин. При добавлении тромбина к раствору фибриногена, нанесенному на поверхность полученной пленки, фибрин не образуется. Пленка с иммобилизованным ферментом хранится в течение 1 мес. при 20 С, полностью сохраняя свою активность, а при хранении в течение 1,5 мес теряет около ЗО % исходной активности. Пример 2. Стадию ацилирования, озонирования и иммобилизации проводят по примеру 1, облучая озонированную пленку в растворе ацилированного фермента и акриламида в течение 3 ч. Активность пленки по отношению к казеину ll,3tO,2 мкг тирозина/мин. Зона растворимости при внесении пленки на поверхность фибрина образуется в тече1те 7 мин. Преврашение фибриногена в фибрин под действием тромбина на поверхности пленки не происходит. Пример 3. Стадию аци;шрования, o3onMpoBatmH и иммобилизации проводят по примеру 1, облучая озонирован56ную пленку в растворе ацклированного фермента и акриламида, к которому пред варителъно добавляют инициатор полимеризадии - рибофлавин в количестве 1О мг/л, в течение 3 ч. Активность пленки по отношению к казеину 26,3±О, мкг тирозина/мин. Зона растворимости при внесении пленки на поверхность фиб рина образуется в течение 5 мин. Превращение фибриногена в фибрин под действием тромбина на поверхности пленки не происходит. Пример 4. Ацнлирование ферме та проводят при 5 С добавлением к. рас твору 2О мг фермента в 1О мл бикарбонатного буфера (рН 7,5) 0,05 г хлор ангидрида метакриловой кислоты, В качестве полимера используют полиэтиленовую пленку толщиной О,О8 мм и площадью 10 , см, а в качестве гидрофильного мономера 2 г оксиэтилметакрила- та. Стадию озонирования и иммобилизации проводят по примеру 1, Активность пленки по отношению к казеину i to,2 мкг тирозина/мин, Фибринолитичес- кая активность пленки аналогична актив ности пленки, полученной в примере 1. П р и м ер 5, Получение тромборё зистентного полимера проводят по примеру 2, используя в качестве ацилирую щегб агента ангидрид акриловой кислоты Свойства материала аналогичны свойств материала, полученного в примере 2, Пример 6. Получение тромборезистентного полимера проводят по примеру 3, используя в качестве полимера плотную ткань из полиэтилентерефталата, а в качестве гидрофильного мономера 1 г метакриламнда. Активнос полученного материала по отноше}шю К казеину 2О,0±0,3 мкг тирозина/мин 5 см 1Фибринолитическая активность ткани аналогична активности пленки, по лученной в примере 3, . . Пример 7, Ацилирование фермента проводят при 2О С добавлением к раствору 10О мг фермента в 10 мл фосфатного буфера (рН 7,0) 0,002 г хлорангидрида акриловой кислоты. После добавления хлорангидрида раствор перемешивают в течение 10 мин и к ра твору добавляют 5 г акриламида. Озонирование пластины из полиметилмета- к.рилата толщиной 3 мм и дааметром 50 мм проводят при 100 С, пропуская над обезжиренной поверхностью пластины озон со,скоростью 3 л/ч в течение 30 миъи Озонированную пластину помещают в раствор ацилированного фермента и акриламида. Раствор вакуумируют до 5-10 мм рт.ст, и облучают УФ-све- том 30 мин при 6О С, Активность полученной пластины при использовании в качествесубстрата казеина 18,,3 мкг тирозина/мин. Зона растворимости при внесении пластины на поверхность фибрина образуется в течение 13 мин. Превращение фибриногена в фибрин под действием . тромбина на поверхности пластины не происходит, П р и м е р 8, Анилированне фермента проводят при 6 О С, добавляя к раствору 10 мг фермента в 20 мл боратного буфера (рН 9,0) 0,012 г хлорангидрида акриловой кислоты. Сразу после добавления хлорангидрида к раствору добавляют. Ю,02, г акриламида, Озонирова- ние полипропиленовой пленки проводят при О С, пропуская озон со скоростью 5 л/ч в течение 20 ч. Озонированную пле1жу толщиной 0,1 мм и площадью 10 см и инициатор) полимеризации - рибофлавин в концентрации 15 мг/л помещают в раствор ацилированного фермента и акриламида и раствор вакуумиру- ют до 10 мм рт,ст. Раствор облучают видимым светом (лампа накалива тя мощностью 250 Вт) 6 ч при О С. Активность полученной пленки 13,7iO,3 мкг тирозина/мин. Зона растворимости при внесегти плешщ на гговерхность фибрина образуется за 7 мин. Превращение фибриногена в фибрин под действием тромбина на поверхности пленки не происходит. Из рассмотренных примеров видно, что по предлагаемому способу получают стабильные тромборезистентные полимеры, которые не только предотвращают образование тромба, но и катализируют растворение уже сформировзавщегося сгустка фибрина без привлечения внутрен- них ресурсов орагнизма. То есть в данном случае эффект тромборезистентности обусловлен не активацией-профибринолизина, а непосредственным воздействием иммобилизованного j фермента на процессы тромбообразования ифибрш-юлиза. Дополнительный вклад в повышение гемо- совместимости вносит гидрофнлизация поверхности полимерного материала за счет привитой сополимеризации гидрофильного мономера в процессе иммобилизации фермента. Формула изо Г рутения 1, Способ получеш я тромборезистентных полимерных матери.а-юв нммобклиза-

цией на их поверхности ферментов, отличающийся : тем, что, с пелью повышения тромборезистентной и фибринолитической активности и стабильности полимерного материала, полимерный материал предварительно озонируют и иммобилизацию проводят в присутствии гидрофильного ненасыщенного мономера под действием инициатора ра дикальной полимеризации, а в качестве : фермента используют ацилированный ангидридом или хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты фибринолити ческий фермент, выделенный из Aciinoтуоев Asroides шт. 1,

2,Способ по п,1, отличающийся тем, что в качестве исходного полимерного материала используют полиэтилен, полипропилен, полистирол, погаяметилметакрилнт, сложные полиэфиры,

3,Способ, по п,1, отличаю - fix и и с я тем, что в качестве гидро льного ненасыщенного мономера ис-

пользуют акриламид, метакрнламид, оксиэтилметакрилат,

4, Способ по п,1, отличающийся тем, что в качестве инициатора полимеризации используют веще- ртвенные инициаторы, например динитрил бисазоизомасляной кислоты или рибофлавин, или УФ-излучение.

S. Способ по n.iu 1-4, отличающийся тем, что процесс иммобилизации осуществляют при 0-6 О С,

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.0о-Ь Тромборезистентные материа- льцТгап5. Ашег. SOC. Artif 1сча anternqt. Organs, 10,213,19644

2.Ku$serowU:K.,Iai-rONX/ RW.,4JctiQEe Синтетическая поверхность, покрытая ковалентнЬ сщитой урокиназой, Transactiovi AmericoiH Sociei for|

Ar-tif-iciqtXnteirndi. ,-i);8,(1

(прототип..