Способ получения тромбо-резистентных полимерных материалов Советский патент 1979 года по МПК C07G7/02 C08F12/08 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБОРЕЗКСТЕНТНЫХ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ Однако этот способ обладает отсутствием химической связи между молекулами фермента и полимерного материала, вследствие чего возможна десорбция фермента с поверхности полимера; отсут ствием действия урокиназы на тромб (урокиназа как и другие протеолитические ферменты лишь активирует превращение присутствующего в живом организме неактивного профйбринолизина в фибринолизин ермент, катализирующий растворение тромба); достаточно высокой протоолитической активностью урокиназы вслед ствие чего возможно растворение щва между искусственным и естественным органом под действием этого фермента; трудностью стерилизации уже готового полимерного изделия, так как ь процессе стерилизации под действием химических или физических агентов возможна денатурация, фермента с потерей его ак- тивйости. Цель изобретения - повышение тромборезистентности и уменьшение протео- литической активности при иммобилизации и получение стерильных тромборезистент- ных полимеров, способных непосредственн и достаточно специфически воздействоват на процессы тромбообразования и фибри- нолиза,. Для этого предлагается способ получения тромборезистентных полимерных материалов, заключающийся в том, что проводят иммобилизацию ацилированного ангидридом или хлорангихфидом акрилевой или метакриловой кислоты фибриноли тического фермента, выделенного из Avcti howaces врЪего дезщт, 1, в присутстВИИ ненасыщенного гидро4«льного мономера под действием ионизирующего излучения. Иммобилизацию фермента проводят обычно в вакууме или в атмосфере инерт ного газа, например аргона или азота, облучением ионизирующим излучением полимерного материала, погруженного в раствор ацилированного фермента и rHj рофильного мономера. Иммобилизацию пр водят при в суммарной дозе 0,1-10 - 4-1 СРрад. Весовое соотношение адйлированные фермент:гидрофильный мономер l:feO-800. Основной отличительный признак изоб тения - использование фибриолитического фермента. Условия проведения процесса иммобилизации фермента (рН, температура и соотношения реагентов) полность обусловлены физико-химической и йюлоической природой самого фермента и полимерного носителя и могут измешггь- ся в довольно широких пределах. Суммарная доза облучения выбрана так что обеспечивает стерилизацию полимера, В качестве гидрофильного мономера предпочтительно применяют акриламид, метг.криламид, эксиэтилметакрилат и т,п,, а в качестве ис Ьодного полимерного материала - полиэтилен, полистирол, поли- винилхлорид, сложные полиэфиры, поли- метилметакрилат и т.п, Ацилиррванный фермент получают добавлением к раствору фермента с концен- традией 0,5-10 мг/мл ангидрида или xлopaнгй Ц)идa акриловой или метакриловой кислоты при рН 7,0 9,0, температуре 0-6 О С и при мольном соотношении ферментангкдрид или хлораигидрид кислоты l:lO-500i Стерилизация полимерного материала и Повышение специфичности фермента по отношению к фибрину достигаются автоматически в процессе иммобилизации под действием ионизирующего излучения. Приме р 1, Ацилирование фермента проводят при О°С добавлением к раствору 20 мг фермента в 15 мл бикарбо- натного буфера (рН 8,0) 0,ОЗ г хлор- aш Ijtфидa акриловой кислоты. После до- баЕшения всего количества хлорангидри- да раствор перемешивают в течение 15 мин. В подученном растворе растворяют 4 г акриламида, В ампулу с раствором помещают предварительно обезжиренную диэтиловым эфиром полиэтиленовую пленку толщиной О,О5 мм и площадью 10 см. Ампулу вакуумируют до 10 мм рт,ст, и запаивают. Ампулу облучают -излучением Со (мощность дозы Ю рад/ч), дозой О,3 10 рад. Ампулу вскрывают в стерильных условиях и облученную пленку промьюают бикарбонатным буфером. Активность полученной пленки при использовании в качестве субстата 1 %-ного раствора казеина равна 9,6iO,3 мкг тирозина/мин. Потери протеолитической и фибринолитической активности фермента при облучении раствора ацилированного фермента Б отсутствие гигрофильного мономера и полимера дозой 0,3/10 рад составляют 35 и 8 %, соответственно. При внесении по ченной пленки на поверхность сгустка фибрина зона растворимости образуется за 7 мин. При добавлении тромбина к раствору фибриногена, нанесенному на поверхность полученной пленки, фибрин не образуется. Пленка с иммобилизованным ферментом хранится в течение 1 ма при 20 С без потери активности фермен та, а при хранении в течение 1,5 мес теряет около 30% исходной активности. Полученная пленка стерильна, о чём свидетельствует отсутствие помутнения бульона хотитЕггера после инкубации пленки и в бульоне в течение 2 сут. Пример 2, Стадии ацилирования и иммобилизации фермента проводят по пр меру 1, добавляя к раствору фермента 7 г акриламида. Активность полученной пленки по отнои ению к казеину равна 27,8iO,3 мкг тирозина/мин,Зона раст воримости при внесении пленки на по верхность фибрина образуется в течение 4 .мин. Превращение фибриногена в фиб рин под действием тромйана на поверхности пленки не происходит. Пример 3. Стадии ацилирова ния и иммобилизаций фермента проводят по примеру 2, используя в качестве ацИ лирующего агента О,ОЗ г хлорангидрида метакриловой кислоты. Доза облучения составляет 1 10 рад. Активность попу- ченной пленки по отношению к казеину равна 15,1±0,2 мкг тирозина/мин. По- тери протеолитической.и фибринолитическ активности фермента при облучении ацили ровашюго фермента в отсутствие акри- ламида и полимерного материала дозой ilQ рад. составляет 7О и 4О %, со ответственно. Зона растворимости при внесении пленки на поверхность фибрина образуется в течение 5 мин, Превраше- ние фибриногена в фибрин под действием тромби за на поверхности пленки не про исходит. Пример 4, Стадии ацилирования и иммобилизации проводят по примеру 2, используя в качестве адилнрующего та 0,03 г ангидрида акриловой кислоты, а в качестве исходного полимера поли- пропиленовую пленку толщиной 0,1 мм и площадью 10 см. Активность полученной пленки по отношению к казеину рав« на 14,7±0,3 мкг тирозина/мин, Фибри«политическая активность плешш анало гична активности пленки, полученной в примере 2, Пример 5, Стадии ацилирования и иммобилизации проводят по примеру 2, используя в качестве гидрофильного мономера 2 г оксиэтилметакрилата, Актив ность полученной пленки по отношению кказекнуравнаЮД 0,2мкгтирозина/мин Фибринолитическая активность пленки аналогична активности пленки, полу ченной в примере 1, Пример 6, Стадии адилирования проводят по примеру 1, используя в качестве гихфофильного мономера4 г ме- такриламида а в качестве полимерного материала плетеную ткань из полиэтилен- терефталата. Активность полученной пленки по отношению к казеину равна 15,3 t 0,3 мкг тирозина/мин 5 см. Фибриноли-, тическая активность пленки аналогична активности пленки, полученной в примере 3. Пример 7о AmiraiposaHHe фермента проводят при добавлеш1ем к раотвору 1ОО мг фермента в 1О мл фосфатного буфера (рН 7j,O) 0,002 г хлоран- , гидрида акриловой кислоты. После добавления хлорангидрида раствор перемешивают в течеш1е 1О мип н к раствору добавляют 5 г акриламида. В полученный раствор вносят пластину из полиметилметакри- лата толщиной 3 мм Д 1аметром 50 мм, раствор вакуумируют до 5-1О мм рт,ст, облучают J -лучами Со с суммарной дозой 410 рад при , Активность полученной пластины по казеину iO,ltO,3 мкг тирозина/мин. По.тери про- теолитической п фибрннолитнческой активности фермента при обяученш раствора адияпроваиного фермента в отсутствии акрпламица .1ера дозой Ij X рад составляет 90 it, 5О% соответствен- но. Зона растворимости при внесешш пластины на поверхность фибрина образу- ется за 15 мин. Превращение фибриногена в фибрин под де{1Ствнем тромбина на поверхности пластины.не происходит,. Пример Во Алилкроваш1е фермента проводят при 60 С добавляя к раствору 10 мг ферлмента в 20 мл борат ного буфера (рН 9,0) 0,12 г хпорангидрида акриловой кислоты. Сразу после добавления хлорангидрида к раствору дабавляют 0,02 г акриламида. В полученный раствор вносят полипропиленовую пленку толщиной 0,1 мм и п лошадью 10 см раствор вакуумируют до IOTVIM рт.ст. и облучают -лучами с дозой РДК 10 рад прц 60°С в течение 6 мин, Активность полученной пленки по казеину ll,4tO,3 мкг тирозина/мин. Потеря протео штаческой.и фибринолитической активности фермента при облучении ацилированного фермента в отсутствии акриламида и полимера составляет 95 и 50%, соответственно. Зона растворимости при вне- Сении пленки на поверхность фибрина образуется в течение 8 мин. Превращение фибриногена в фибрин под действием тром бина на поверхности пленки не происходит,. Из рассмотренных примеров видно, что по предлагаемому способу получают стабильные и стерильнь е полимерные материалы, которые не только предотвращав ют о азование тромба, но и катализИ руют растворение уже сформировавшегося сгустка фибрина без привлечения внутренних ресурсов организма, В данном случае эффект тромборезистенТности обуслов лен не активацией присутствующего в живом организме профибринолизйна, а непосредственным воздействием иммобилизованного фермента на прсдаессы тромбо- образования и фибринолиза. Кроме того, осушествление иммобилизации с помощью ионизирующего излучения позволяет в значительной степени регулировать специ фичность действия иммобипизовавяого фермента по отношению к фабрику. Так при дозе Ю рад потеря фибринолитнческой активности составляет 40% от исходной активности, а потеря протеолитической активности составляет 7 О%, Последнее означает, что использование предлагаемого способа позволяет получать тромборезистёнтные полимерные материалы с резко выраженными фибринолвтическими свойствами, но пониженной протеолетнческой активностью, то есть с понижеайо склонностью к гидролизу места соединения тромборезистентного полимерного материала с естественной тканью. Дополнительный вклад в повышение тромборе- зистентности вносит гидрофилизадия поверхности полимерного материала за счет привитой сополимеризадии ненасыще ного гидрофильного мономера, которая ос ществляется одновременно с процессом иммобилизации фермента. Формула изобретения 1,Способ получения тромборезистент- ных полимерных материалов иммобилизацией на их поверхности ферментов, о т- личающи йс-я тем, что, с целью повышения тромборезистенТности и уменьшения протеолитической активности целевого продукта с одновременной. его стерилизацией, в качестве фермента используют айилированный ангидридом или хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты фибринолитический фермент, выдейённый из JUtirtwrrUj шт, 1, и иммобилизацию ведут з присутствии ненасыщенного гидрофильного мономера под действием ионизирующего 1аз- лучения, 2,Способ поп,1, отличающийся тем, ч то в качестве ненасыщенного гидрофильного мономера используют акриламвд, метакриламид, оксиэтит4ет,крилат, 0.Способ ПОП.1, отличающ и и с я тем, что в качестве полимерного материала используют полиэтилен, полипропилен, полистирол поливинилхло- рид, сложные полиэфирьи Источники информации, принятые во внимание При экспертизе 1.Полимеры в медвщине, М,, Мир, 1969, с. 126. 2,Kusserow B.Kv2La) ,Ni ctiofcs 3-Е.,Синтетическая поверхность покрытая ковалентно сшитой уро1аанафй,Тга|П5..г,.SoCibr. . -gnternat ,19,6,1973 juooToTmi).