Субстрат для закрепления бактерий и способ хранения неспорообразующих бактерий рода @ Советский патент 1984 года по МПК C12N1/04 

Изобретение относится к микробио логия и методам хранения мт- кроорганизмов, предназначенных для очистки загрязненных вод. Известен субстрат для закрепления спор актиномицетов, содержащий песок в смеси с почвой П , Недостатком указанного субстрата (является то, что он предназначен дляхранения спор и не пригоден для адсорбции клеток неспорообразующих бактерий, например рода Pseudomonas без предварительной лиофилизации. Известен также субстрат для закрепления споровых бактерий Thiobaci lus ferrooxidans, содержащий песок смеси с пиритом р . Однако известный субстрат не при годен для хранения неспорообразу1ощих бактерий. Цель изобретения - удлинение сро ков хранения неспорообразующих бактерий рода Preudomonas. Поставленная цель достигается тем, что субстрат для закрепления бактерий, содержащий песок, дополнительно содержит рыбную муку при соот ношении компонентов, об.%: рыбная мука 80-85; песок 15-20. Известен также способ хранения неспорообра:зующих бактерий, предусма ривающий адсорбцию микроорганизмов вдисперсном субстрате, согласно кот рому лиофилизированные клетк бактерий адсорбируют на гранулах пемзы 3. К недостаткам известного способа следует отнести необходимость исполь зования специальной дорогостоящей аппаратуры для лиофилизации культур бактерий, для некоторых культур хранение в лиофилизированном состоянии на гранулах пемзы не превышает бмес 4to недостаточно. Цель изобретения - упрощение способа и удлинение сроков сохранения биохимической активности неспорообра зующих бактерий рода Pseudomonas. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу хранения неспорообразующих бактерий рода Pseu domonas ,предусматривающему адсорбцию бактерий в дисперсном субстрате, абсорбцию осуществляют в процессе культивирования бактерий с субстратом, в качестве которого используют смесь рыбной муки с песком, взятых в соотношении 4:1-5,7:1, внесенную 98 1 . в среду в количестве 10 об., с последующим отделением адсорбированной биомассы, промыванием ее стерильным физиологическим раствором и помещением в стерильный 0,8-1,0%-ный раствор хлористого натрия при соотноще|нии биомассы и раствора 1:8-1:10. Пример 1. Осуществляют закрепление на субстрате и хранение штамма бактрий деструкторов Ps.aeruginosa KM, способных разрушать органические красители, и предназначенные для очистки сточных вод высокой цветности. В качестве субстрата для закрепления бактерий применяют рыбную муку, промытую в течение суток проточной 1ВОДОЙ и прокаленную при 200. С в течение 4 ч. Обработанная таким образом мука представляет собой порошок коричневого цвета. Для предупреждения комкования муку смешивают с песком, который подвергают аналогичной пред-варительной обработке. Песок и рыбную муку смешивают пр.и следукицем соотношении компонентов, об.%: мука 80j песок 20. Для одного опыта берут 40 см муки и 10 см песка. Суточную агаровую культуру бактерий в дозе 500 млн клеток/мл вносят в минеральную среду М-9 следукмцего состава: калий фосфорнокислый однозамещенный 3,0 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный 6,0,- натрий хлористый 5,0.; аммоний хлористьй 1,0 г«,вода дистиллированная 1000 мл, рН среды устанавливают добавлением 10%-ного .раствора кальция гидрата. В минеральную среду дополнительно вносят субстрат для окисления краситель кислотный черный С в концентрации 25 мг/л. Субстрат для адсорбции бактерий вносят в минеральную среду указанного состава в количестве 10 об.%, т.е. к 300 см среды добавляют 30 см субстрата. Адсорбцию культуры на субстрате осуществляют в процессе культивирования в течение 48 ч при . Затем закрепленные на субстрате клетки бактерий отмывают дважды стерильным физиологическим pacTBopoMj после чего субстрат с закрепленными клетками переносят в 8 пробирок размером 25 х X 1,5 см в количестве 3 см и заливают 24 см стерильного 0,8%-ного аствора хлорида натрия (объемные соотношения субстрата и раствора

1:8). Культуру хранят при А С и при комнатной температуре, По истечении определенных сроков хранения (6,9,12 и 24 месО изучают жизнеспособность и деструктивную активность штамма Ps.aeruginosa,

Проверку жизнеспособности и деструктивной активности бактерий после хранения в условиях периодического культивирования осуществляют следующим образом.

Для реизоляции бактерий после хранения субстрат с закрепленными клетками промывают 3 раза стерильным физиологическим раствором, растирают в стерильной ступке,а затем используют как инокулят при посеве в минеральную среду М-9. После культивирования в течение 48 ч при проводят рассев на поверхность мясопептонного агара в чашках Петри для выделения чистой культуры.

Припроверке окислительной (деструктивной) активности бактерий используют суточную агаровую культуру, которую в дозе 500 млн клеток/мл вносят в минеральную среду М-9, содержащу1р загрязняющее вещество - краситель кислотный черный С в концентрации 100 мг/л.

Микробиологическое окисление осуществляют в процессе периодического культивирования при 30 С в течение 48 ч в стационарных условиях.

Результаты деструкции учитывают методом фотоэлектроколориметрии на ФЭК-56 при Л 750-760 мм (красный светофильтр) после осаждения микробных клеток центрифугированием при 4 тыс. об/мкн в течение 8 мин.

Культура бактерий Ps. aeruginosat после 6,9,12 и 24 мес,хранения независимо от .температурного режима сохраняет способность к росту в минеральной среде М-9 и вызывает 98-100% деструкцию йрасителя кислотного черного С (таблица).

Пример 2. Осуществляют з крепление на субстрате и хранение штамма-бактерии деструкторов Ps.fluo rescens.2. Обработку рыбной муки И песка осуществляют как указано в примере 1.

Муку и песок смещивают при следую щем соотношении компонентов, об.%: мука 85; песок 15. Дпя опыта берут 43 см муки и 8 см песка. Суточную агаровую культуру бактерий в дозе

500 млн клеток/мл вносят в минеральную среду М-9, в которую дополнительно вводят субстрат для окисления краситель кислотный черный С в концентрации 75 мг/л. Дцсорбцию культуры на субстрате осуществляют как указано в примере 1. Хранение осуществляют в 8 пробирках под слоем стерильного 1,0%-ного раствора хлорида натрия при объемном соотношении субстрата и раствора 1:10 (3см субстрата заливают 30 см раствора хлорида нат рия), при 4 С и при комнатной температуре.

По истечении определенных сроков хранения (6,9,12 и 24 месО изучают жизнеспоосбность и деструктивную а1 :тивность штамма Ps .f luirescens 2°, как указано в примере 1 (загряз11Итель - краситель кислотный черный С в концентрации 75 мг/л) .

Культура бактерий Ps.luorescens2 после 6,9,12 и 24 мес, хранения независимо от температурного режима сохраняет способность к росту в минеральной среде М-9 и вызывает 90-100% деструкцию красителя кислотного черного С в концентрации 75 мг/л (таблица) .

Пример 3. Осуществляют закрепление на субстрате и хранение штамма бактерий - деструкторов Ps. species 6,предназначенных для очистки от формальдегида сточных вод химических производств.

Обработку рыбной муки и песка осуществляют, как в примере 1. Муку и песок смешивают при следующем соотношении компонентов, об.%: мука 82,5; песок 17,5. Для опыта берут 41 см муки и 9 см песка.

Суточную агаровую культуру бактерий в дозе 50 млн клеток/мл вносят в минеральную среду М-9, в которую дополнительно вводят субстрат для окисления - формальдегид в концентрации 100 мг/л. Адсорбцию культуры на субстрате осуществляют как ук.азано в примере 1. ,

Хранение осуществляют в пробирках под слоем стерильного 1,0%-ного раствора хлорида натрия при объемном соотношении субстрата и раствора 1:9 (3 см субстрата и 27 см раствора хлорида натрия), при 4°С и при комнатной температуре.

По истечении определенных сроков ( хранения аналогично изучают жизнеспособность бактерий и деструкцию формальдегида в концентрации 500 мг/л колориметрическим методом с применением хромотроповой кислоты.

Штамм PS.species 6 после 6,9,12 и 24 мес. хранения независимо от температурного режима сохраняет способность к росту в минеральной среде М-9 и вызывает 95-1OOZ деструкцию формальдегида (таблица).

Таким образом, после 24 мес.хранения предлагаемый способом на новом субстрате бактерии сохраняют высокую окислительную активность, что позво- ляет использовать их для микробной очистки водной среды от токсикантовзагрязнителей после длительного хранения.

Предлагаемое изобретение упрощает процесс хранения микроорганизмов.

Возможность .использования бактерий для микробной очистки водной среды от токсикантов-загрязнителей после длительного хранения обусловливает экологический эффект в аспекте борьбы за охрану окружающей среды.

Таким образом, реализация изобретения позволяет длительно хранить неспорообразующие бактерии рода Pseudomonas, используя упрощенный способ хранения, и-обеспечить сохранение их биохимической активности.

1. Субстрат для закрепления бактерий, содержащий песок, о т л йчающийся тем, что, с целью удлинения сроков хранения неспорообразующих бактерий рода Pseudomonas, субстрат дополнительно содержит рыбную муку при соотношений компонентов, об.%: рыбная мука 80-85, песок 15-20. 2. Способ хранения неспорообразующих бактерий рода Pseudomonas, предусматривающий адсорбцию бактерий в дисперсном субстрате, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и удлинения сроков сохранения биохимической активности бактерий рода Pseudomonas, адсорбцию осуществляют в процессе культивирования бактерий с субстратом, в качеi стве которого используют смесь рыбной муки с песком, взятых в соотно(/ шении 4:1-5,7:1, внесенную в среду в количестве 10 об.% с последующим отделением адсорбированной биомассы, с промыванием ее стерильным физиологическим раствором и помещением в стерильный 0,8-1,0%-ный растзор хлористого натрия при соотношении биоСО массы и раствора 1:8-1:10. СлЭ 05 СО 00