Субстрат для закрепления бактерий и способ получения неспорообразующих бактерий рода рSеUDомоNаS Советский патент 1982 года по МПК C12N1/04 

( СУБСТРАТ ДЛЯ ЗАКРЕПЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ

И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕСПОРООБРАЗУЮ1ЦИХ БАКТЕРИЙ РОДА PSEIJDOHONAS

Изобретение относится к микробиологии и методам хранения микроорганиз МОЕ, предназначенных для очистки загрязненных вод, Известен субстрат для закрепления спор актиномицетов, содержащий песок в смеси -с почвой 1 . Недостатком указанного субстрата является то, что он предназначен для хранения спор и не пригоден для адсорбции клеток неспорообразующих бактерий, например, рода Pseudononas без предварительной лиофилизации. Известен субстрат для закрепления споровых бактерий ThiobaciBPus ferrokicPous, содержаи1ий песок в смеси с пиритом 2. Однако этот субстрат также не пригоден для хранения неспорообразующих бактерий. . Известен также способ получения и хранения неспорообразуюи(их бактерий, предусматриваюций адсорбцию микроорганизмов в дисперсном субстрате, согласно которому лиоЛилизированные клетки бактерий адсорбируют на гранулах пемзы недостаткам данного способа следует отнести необходимость использования специальной.дорогостоящей аппаратуры для диофилизации культур бактерий. Для некоторых культур хранение в диофилизированном состоянии на гранулах пемзы не превышает 6 мес, что недостаточно. Цель изобретения - упрои ение способа и .удлинение сроков сохранения биохимической активности неспорообразующих бактерий рода Pseudononas. Поставленная цель достигается тем, что субстрат для закрепления бактерийj содержащий песок, дополнительно содержит рыбную муку при соотношении компонентов, вес.: Рыбная мука 80-85 Песок 15-20 а также тем, что согласно способу получения неспорообразующих бактерий 398135 рода Pseudomonas, предусматривающему адсорбцию микроорганизмов в дисперсном субстрате, адсорбцию осуществляют в процессе культивирования бактерий с cyfJcTpaTOM, в качестве которого используют смесь рыбной муки с песком, взятых в соотношении 4:1 - 5,7:1 внесенного в среду в количестве 10 с последующим отделением адсорбированной биомассы, промыванием ее стерильным физиологическим раствором И помещением в стерильный 0,8-1, раствор хлористого натрия при соотношении биомассы и раствора 1:8-1:10. Пример 1. Осуществляют за- is крепление на субстрате и получение и хранение штамма бактерий деструкторо PS. aeruginosa КМ, способных разрушать органические красители и предназначенные для очистки сточных вод высокой цветности. В качестве субстрата для закрепле ния бактерий применяют рыбную муку, промь,1тую в течение суток проточной водой и прокаленную при 200 С в течение (-X часов. Обработанная таким образом мука представляет собой поро шок коричневого цвета. Для предупреж дения комкования муку смешивают с песком, который подвергают аналогичной предварительной обработке. Песок и рыбную муку смешивают при следующем объемном соотношении компонентов, %: мука 80; песок 20. Для одного опыта берут АО см муки и 10 см песка , Суточную агаровую культуру бактерий в дозе 500 млн клеток/мл вносят в минеральную среду М-9 следующего состава, г: калий фосфорнокислый однозамещенный 3,0; аммоний хлористый 1,0, вода дистиллированная 1000 мл. рН среды устанавливают добавлением 10 раствора кальция гидрата. В минеральную среду дополнительно вносят субстрат для окисления - краситель кислотный черный С в концентрации 25 мг/л. Субстрат для адсорбци бактерий вносят в минеральную указанного состава в количестве 10 обо%, т.е. в опыте к 300 см среды добавляют 30 см субстрата. Адсорбцию культуры на субстрате осуществляют в процессе культивирова .ния в течение 48 ч при 30°С. Затем, закрепленные на субстрате клети бактерий отмывают дважды стерильным физио логическим раствором, после чего суб страт с закрепленными клетками переJ10 4 носят в 8 пробирок размером 25 х х 1,5 см в количестве 3 см и заливают 2| см стерильного 0,8 -ного раствора хлорида натрия ( объемные соотношения субстрата и раствора 1:8. Культуру хранят при +4°С и при комнатной температуре. По истечении определенных сроков хранения (6,9, 12 и 2 мес ) изучают жизнеспособность и дестру(стивную активность птамма Ps. aeruqinosa KM. Проверку жизнеспособности и деструктивной активности бактерий после хранения в условиях периодического культивирования осуществляют следующим образом. Для реизоляции бактерий после хранения субстрата с закрепленными клетками промывают 3 раза стерильным физиологическим раствором, растирают в стерильной ступке, а затем используют как инокулят при посеве в минеральную среду М-9. После культивирования в течение 48 ч при 30°С производят рассев на поверхность мясо-пептонного агара в чашках Петри для выделения чистой культуры. При проверке окислительной ( деструктивной j активности бактерий используют суточную агаровую культуру, которую в дозе 500 млн. к-к/мл вносят в минеральную среду М-9, содержащую загрязняющее вещество - краситель кислотный черный С в концентрации 100 мг/ло Микробиологическое окисление осуществляют в процессе периодического культив.ирования при 30 С в течение 48 ч в стационарных условиях. Результаты деструкции учитывают методом фотоэлектроколориметрии на ФЭК-56 при А 750-760 мм (красный светофильтр} после осаждения микробных клеток центрифугированием при 4 тыс. об/мин в течение 8 мин. Культура бактерий Ps. aeruginasa KM после 6, 9, 12 и 24 мес. хранения независимо от температурного режима сохраняет способность к росту в ми неральной среде М-9 и вызывает 98100 -ную деструкцию красителя кислотного черного С (таблица). Пример 2. Осуществляют закрепление на субстрате и получение и хранение штамма бактерий деструкторов PS. fluorescens ., Обработку рыбной муки и песка осуществляют как указано в примере 1.

Муку и песок смешивают при следующем объемном соотношении компонентов, %: мука 85;о песок 15- Для опыта берут З см и 8 см песка.

Суточную агаровую культуру бактерий D дозе 500 млн к-к/мл вносят в минеральную среду М-9, в которую дополнительно вводят субстрат для окисления - краситель кислотный черный С в концентрации 75

Адсорбцию культуры на субстрате осуществляют как указано в примере 1.

Хранение осуществляют в 8 пробирках под слоем стерильного 1,0%-ного раствора хлорида натрия при объемном соотношении субстрата и раствора 1:10/3 см субстрата заливают 30 см раствора хлорида натрия, при +if С и при комнатной температуре

По истечении определенных сроков хранения (.6, 9, 12 и мае) изучают жи-знеспособность и деструктивную активность штамма Ps. fPuorescens 2, как указано в примере 1 (загрязнитель - краситель кислотный черный С в концентрации 75 мг/л ),

Культура бактерий Ps. fPuorescens 2 после 6, 9, 12 и 2 мае хранения независимо от температурного режима сохраняет способность к росту в минеральной среде М-9 и вызывает 90100 -ную даструкцию красителя кислотного черного С в концентрации 75 мг/л

Пример 3. Осуществляют закрепление на субстрате и получение и хранение штамма бактерий деструкторов PS. species 6, предназначенных для очистки от формальдегида сточных вод химических производств.

Обработку рыбной муки и паска осуществляют, как указано в примера 1. Муку и пасок смешивают при следующем (Объемном соотношении компонентов,: мука 82,5; пасок 17,5. Для опыта берут 1 см муки и 9 см песка.

Суточную агаровую культуру бактерий ti доза 500 млн к-к/мл вносят в минеральную среду М-9, в которую дополнительно вводят субстрат для окисления - формальдегид в концантрации ,100 мг/л.

Адсорбцию культуры на субстрате осуществляют как указано в примере 1,

Хранение осуществляют в пробирках под слоем стерильного 1,0%-ного раствора хлорида натрия при объемном соотношении субстрата и раствора 1:9/ /3 см субстрата и 27 см раствора хлорида натрия при +Ц°С и при комнатной температуре.

По истечении определенных сроков хранения изучают жизнеспособность бактерий, как указано, и деструкцию формальдегида в концентрации 500 мг/л колориметрическим методом с применением хромотроповой кислоты.

Птамм PS. species 6 после 6, 9 12 и t.k мес хранения независимо от температурного режима сохраняет способность к росту в минеральной среде М-9 и вызывает деструкцию формальдегида.

Схема опыта и сроки хранения биохимически активных бактерий представлены в таблице.

Т.е., на примере 3 штаммов бактерий деструкторов рода Psaudomonas установлено, что после мес хранения предлагаемым способом на новом субстрате бактерии сохраняют высокую окислительную активность, что позволяет использовать их для микробной очистки водной среды от токсикантов-загрязнителей после длительного хранения.

Предлагаемое изобретение обуславливает социальный эффект, так как упрощает процесс хранения микроорганизмов.

Возможность использования бактерий для микробной очистки водной среды от токсикантов-загрязнителей после длительного хранения обусловливает экологический эффект в аспекте борьбы за охрану окружающей среды.

Таким образом, реализация изобретения позволяет длительно хранить не спорообразуюи1ие бактерии рода Pseudomonas, используя упрощенный способ хранения и обеспечить сохранение их биохимической активности.

JCM

о

vO

СП

CO

s s J

0

«

s «.

(U LO

TO

n

0)

n:

с s

H

o

H

o a

СУ &Q

31 Lr L.,

Ш 3

(3 чО 7 m

о u)

IT СП

rvl rо о

CO -

00 гс -3 a z «x м

Ь

л (U о

о Ш ж

го О

ft) it

(С о X о и v и

Z0) и

X

0)

s:

Z (

ж; с:

tj с

о.

a

а

0) ш

0)

S

з: а

s

о.

Q.

Формула изобретения

1 о Субстрат для закрепления бактерий, содержащий песок, отличающийся тем, что, с целью удяинения сроков хранения неспорообразующих бактерий рода Pseudomonas, субстрат дополнительно содержит рыбную муку при соотношении компонентов, вес.%: .

Рыбная мука 80-85

Песок15-20

10

торого используют смесь рыбной муки с песком, взятых в соотношении trl5,7tl, внесенного в среду в количестве 10% с последующим отделением адсо бированной биомассы, промыванием ее стерильным физиологическим раствором и помещением в стерильный 0,81 ,0%-ный раствор хлористого натрия при соотношении биомассы и раствора 1:8-1:10.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1967, ,

кл. С 12 N 1/00, 1979.

3.JuvenB.I. А simple method for long-termpreservation of stock cultures of lacti acid bacteria. - J. . Bacteriol., 1979, «7 N 9.