со со
О1
О)
а vi
.
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий, которьй може быть использован для очистки морской воды от нефтяных загрязнений.
Цель изобретения - получение нового штамма бактерий-, обладающего более высокой деструктивной активностью по отношению ,к комплексам угле- водородов и ксенобиотиков в сильно минерализованных средах.
Штамм бактерий Pseudomonas sp. ;BKIIM В-3829 (4-а) выделен из морской воды Берингова моря в 1981 г. и обла дает способностью использовать в качестве углерода и энергии нефть и нефтепродукты, в которых главный ком :понент -н -алканы с высокой ( :и средней молекулярной массой (от С |до С), окислять углеводороды при |широком диапазоне их концентрации. ; Полное разрушение углеводородов и |ксенобиотиков происходит в морской |среде при использовании дополнитель |Ных биогенных субстратов, например |дестибиотина, дрожжевого экстракта, : Штамм Pseudomonas species 4-а об- ладает следующими признаками.
Морфолого-культуральные признаки. ;11рямые палочки, размеры 1-2x055- ;0,6 мкм, подвижные, грамотрицатель- ;ные, неспорообразующие. I На рыбо-пептонном агаре,колонии Iбесцветные с гладкими краями, круг- лые, блестящие, выпуклые, консистен- |ция однородная, диаметр колоний 3 - |4. мм.
; На рыбо-пептонном бульоне рост в виде равномерного помутнения.
Растет на средах с морской водой и на обычных лабораторных субстратах Колонии вначале прозрачные, потом становятся слегка кремовыми. Неспоро образукнцие.
На среде Кинг: дополнительных пигментов не образует.
На среде с Твин-40, Твин-80: образует фермент липазу.
На синтетической среде (морская соль 1,8%, аммоний хлористый Г,О г/л калий фосфорно-кислый двузамещенньш 1,0 г/л, дестибиотин (0,001%-ного раствора) или дрожжевой экстракт 1 мл/ вода водопроводная 1000 мл, рН среды 7,2-7,5) с добавкой нефти и нефтепродуктов: дисперсный рост с помутнением среды.
5
0
5 0 .
5
0
5
Физиолого-биохимические признаки.
Факультативный аэроб. Способен расти при температуре от -10 до 42,5°С. Оптимум роста 20-27 С. Рост на среде с NaCl 5, 7, 10%-ной и вьше.
Отнощение к рН: оптимум роста в области рН 6,5-8,0, с максимумом при рН 7,5. Выше рН 8,0 и ниже рН 6,5 рост удовлетворительный.
Оксидазы и каталазы образует, леци- тиназы не образует, молоко пептонизи- рует, желатин разжижает. Рост на среде NaCl 0,5, 3, 5, 7 и 10%-ной и выше. Оптимум роста гфи 3-5%-ной NaCl. Индол сероводород и аммиак не образует. Реакция фогэс-Проскауэра - отрицательная. Образует кислоту на среде с глюкозой без наличия газа. Хорощо растут на среде с лактозой и маинитом без образования кислоты и газа..
Отношение к углеводородам. Растет на средах, содержащих нефть, парафин, 0-ксилол, дизельное топливо, вазели- новое масло, смазочное масло. Разлагает ксенобиотики, относящиеся к диа-. 30соединениям. Отношение к антибиотикам: не чувствителен к метициллину, оксациллину, линкомицину, новобиоци- ну, ристомицину, слабо чувствителен к стрептомицину, мономицину. Чуйстви- телен к канамицину, ка рбенициллину, ампициллину, бензилпенициллину, ген- тамицину, левомицину, олеандомицину, полимиксину. Отношение к источникам азота: бактерии штамма Pseudomonas species 4-а-гетеротрофы и могут использовать следующие амминные соединения :
.Формамид HCONHg
Ацетамид CH CGNHi
Пропионамид
Флюороацетамид
Глюк ол амид
Акриламид СН2 СНСОШг
ЛактамидСНэСНОНСОШ.
СНз CH UGNHj CH FCONHs СН ОНСОЖ-г
В качестве факторов роста могут использовать: в-апанин, метионин, L-лизин, пролин, Иг-аргинин, L-гисти- дин, аспарагин, изолейцин, лейцин и валин.
Устойчивость к солям тяжелых металлов проиллюстрирована в табл. 1.
Состав среды для получения биомассы бактерий штамма Pseudomonas species 4-а: рыбо-пептонньй агар 3%,
морская соль (коммерческая) 1,8%, вода водопроводная 1000 мл, дестибиотин (0,001%-ньй раствор) или дрожжевой экстракт 1 МП/л, рН среды 7,0-7,2.
Условия хранения: на скошенном агаре рыбо-пептонном под стерильным медицинским вазелиновым маслом или глицерином при 4°С или в лиофилизированном состоянии.
Штамм Pseudoijionas species 4-а бьт .получен путем испытания на чувствительность морских микроорганизмов к различным источникам углерода.
Для получения использовалась следу нлцая среда, г/л: агар-агар .14,5 г, пептон рыбный 14,5 г, морская соль. 18 г, дестибиотин (1%гньй раствор) 0,1 мл. Водопроводную-Воду добавляли до 1 л рН среды 7,0-7,2.
Расплавленную среду разливали по 15-20 МП в стерильные чашки Петри.
Поверхность застывшей среды засевали чистой культурой бактерий Pseudo- monas species 4-а в количестве ... 0,1 мл/500 млн. взвеси (устанавливают по бактериальному стандарту). Материал наносят с помощью стеклянного шпателя или бактериологической петли.
Бактериальную взвесь равномерно распределяли, чашки подсушивали, после чего на поверхность засеянной среды накладывали диски, пропитанные ра;зличными источниками углеводорода, например нефть, нефтепродукты, ксенобиотики. Чашки культивировали при 25-27°С в течение 12-24 ч и по отсутствию зон вблизи углеводородсодержа- щнх источников или наличию их, опре4 деляли способность штамма Pseudomonas species 4-а расти в присутствии различных химических субстратов.
Сопоставительный -анализ до деструкции углеводородов и -ксенобиотиков различными штаммами бактерий представлены в табл. 2.
Из табл. 2 видно, что штамм бактерий Pseudomonas sp. 4-а способен разлагать любой из класса углеводород- содержащих субстратов. А из класса азокраси елей он расщепляет все ксенобиотики.
Кроме тог о, скорость разложения штаммов Pseudomonas sp. 4-а - тетра- азокрасителя в 2 раза вьш1е. Такая высокая активность штамма обуславливает значительный экологический эффект .
Деструктивная активность штамма . Pseudomonas sp. 4-а в минерализованной среде (морской воде) представлена в табл. 3.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Штамм Pseudomona species 4-а выращивали .на морской среде следующего состава: морская соль 1,8%, аммоний хлористьй 1,0 г/л калий фосфорнокислый д.вузамещенный 1,0 г/л, дестибиотин 0,001% раствора или дрожжевой экстракт 1 мл, вода- водопроводная 1000 мл, рН среды 7,2 - 7,5.
Нефть в качестве субстрата для деструкции вводили.в количестве мг/л 450, 400, .350, 300, 250., 200, 150, 100, 50.и 2250. рН среды регулировал 10%-ным раствором NaOH.
Деструкцию проводили штаммом Pseudomonas species 4-а, предварительно культивированньм на рыбо-пептонном агаре,(РПА) в течение 24-36 ч при 22°С и дважды отмытым минеральной средой указанного состава (без углеводородов) посредством центрифугирования при 4 тыс. об/мин в. течение 10 мин.
С целью создания оптимальных уело ий для деструкции углеводородов клетками бактерий штамм в первые 2 ч помещали на качалку. Последующее - культивирование осуществляли в стацй онарных условиях при 22°С.
Результаты деструкции учитывали по исчезновению нефтяной пленки через 27,4, 24 ч, 21 ч, 18 ч, 15 ч, 12 ч, 9 ч, 6 ч, 3 ч и 6 сут.
Результаты представлены в табл. 4.
Скорость микробной деструкции штаммом Pseudomonas sp. 4-а нефти при этом достигает 16,6 мг/л в 1 ч.
Деструкцию вазелинового масла осуществляли в морской воде, следующей концентрации, мг/л: 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50 и 2750.
Результаты деструкции штаммом Pseudomonas species 4-а регистриро- - вали через 60 ч, 54 ч, 48 ч, 42 ч, 36 ч, 30 ч, 24 ч, 18 ч, 12 ч, 6 ч и 14 сут по исчезновению вазелинового масла в среде.
Результаты микробного разложения вазелинового масла представлены в табл. 5.
Скорость микробной деструкции вазелинового масла 8,3 мг/л в 1 ч.
Пример 2. При микробной деструкции смазочного масла готовили искусственный раствор морской воды, приведенный в примере 1. Смазочное масло в качестве субстрата вносили в следующем количестве, мг/л: А50, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 25 и 2275.
; Результаты деструкции учитывали |по исчезнов.ениш в среде пленки через |54 сут, 48 сут, 42 сут, 36 сут, 130 сут, 24 сут, 18 сут, 12 сут, |б сут, 3 сут и 9 мес.
Результаты деструкции смазочного масла приведены в табл. 6.
i . Скорость микробной деструкции 8,2 мг/л в 1 сут.
I Микробное разложение дизельного топлива осуществляли в морской воде. Количество субстрата вносили в следу- ;ющей концентрации, мг/л: 450, 400, 1350, 300, 250, 200, 150, 100, 25. ; Результаты деструкции учитывали |через 23 сут, 20 сут, 8 сут, 15 сут, из сут, 10 сут, 7,5 сут, 5 сут, |2,5 сут, 1,3 сут и 3,5 мес. : Результаты биодеградации дизельно- 1го топлива штаммом Pseudomonas sp. |4-а представлены в табл. 7. I Скорость микробной деструкции ди- |зельного топлива 19,5 мг/л в сутки. i Пример 3. Микробную деструк цию комплексов углеводородов: нефть и. о-ксилол и дизельное топливо о-ксилол осуществляли приведенным способом..
Количество нефти о-ксилола, а также дизельного топлива о -ксилола вносили в морскую воду для биодеградации в следующем количестве, мг/л: 50, 100, 200, 300, 400, 500, бОО, 700.
Результаты деструкции нефти и о-ксилола учитывали через 1,5 сут, 3 с ут, 6 сут, 9 сут, 12 сут, 45 сут, 18 сут и 21 сут по исчезновению в среде нефти и о-ксилола.
Данные микробного разложения нефти и о -ксилола представлены в табл. 8
Скорость микробной деструкции нефти и о-ксилола 33,3 мг/г в сутки.
Результаты разложения дизельного 55 топлива и о-ксилола под воздействием бактерий регистрировали через 2, 5сут 5 сут, 10 сут, 15 сут, 20 сут, 25 сут,
0
5
0
5 0 Q
45
50
55
30 сут, 35 сут, по исчезновению в морской воде дизельного топлива и о-ксилола (табл. 9).
Скорость микробной деструкции дизельного топлива и о-ксилола 20 мг/л в 1 сут.
Пример 4. Микробную деструкцию штаммов Pseudomonas species 4-а осуществляли в морской среде указанного состава в примере 1.
Ксенобиотики: краситель оранжевый (orange GR), красный (red С-6с.с), желтый (yellow-C), вносили в следующем количестве, мг/л: 200, 1/5, 150, 125, 100, 75, 50, 25 и 900.
Результаты биодеструкции азокра- сителя - красный учитывали через 96 ч, 84 ч, 72 ч, 60 ч, 48 ч, 36 ч, 24 ч, 2 ч по исчезновению оранжевой окраски в среде (табл. Ю).
Скорость микробной деструкции азо- красителя-красный 2,0 мг/л в 1 ч.
Результаты микробного разложения азокрасителя-оранжевьщ учитывали через 192 ч, 168 ч, 144 ч, 120 ч, 96 ч, 72 ч, 48 ч, 24 ч по исчезновению оранжевой окраски в среде (табл. 11).
Скорость микробной деструкции азо- красителя-оранжёвый - 1,04 мг/л в 1ч.
Данные биодеградации азокрасителя- желтьш учитьгоали через 64 ч, 56 ч, 48 ч, 40 ч, 32 ч, 24 ч, 16 ч, 8ч nd исчезновению желтой окраски в среде (табл. 12).
Скорость микробной деструкции азо- красителя-желтьй - 3,12 мг/л в час.
Таким образом, щтамм Pseudomonas species 4-а способен расти при низких () и высоких температурах (42,5°С); максимальная скорость деградации углеводородов составляет: нефти 0,4 г/л, вазелинового масла 0,2 г/л, смазочного масла 8,3 мг/л, дизельного топлива 19,5 мг/л, нефти и о-ксилола мг/л, дизельного топлива и о-ксилола 20 мг/л в сутки, а максимальная скорость деградации ксенобиотиков, входящих в группу азокрасителей соответственно составляет: красителя красного 2,0 мг/л, оранжевого 1,0,4 мг/л желтого
3,12 мг/л, в 1 ч, oiMieKT деструкции углеводородов и ксенобиотиков при
этом составляет 98-100%, устойчив к солям тяжелых металлов от 25 у/мл до lOOOjj /Mn, способен расти в средах
Формула изобретения Штамм бактерий Pneudomonas sp.
с содержанием NaCl (3-12% и выше) с ВКПМ В-3829 деструктор углеводородов
высокой степенью .деградации..
и ксенобиотиков.
Формула изобретения Штамм бактерий Pneudomonas sp.
ВКПМ В-3829 деструктор углеводородов
ВКПМ В-3829 деструктор угле
и ксенобиотиков.
Таблица 1
Изобретение относится к микробиологической промьшшенности и касается нового штамма бактерий, котррый может быть использован для очистки морской воды от нефтяных загрязнений. Целью изобретения является получение нового штамма бактерий, обладающего более высокой деструктивной активностью по отношению к комплексам углеводородов и ксенобиотиков в сильно минерализованных срезах. Штамм Pseu- domonas зр.БКПМ В-3829(4а) выделен КЗ морской воды Берингова моря и обладает способностью использовать в качестве углерода и энергии нефть и нефтепродукты, в которых главный , компонент - н -алканы с высокой (С, - Cj) и средней молекулярной массой (), окислять углеводороды и азокрасители в широком диапазоне концентраций. Максимальная скорость деградации углеводородов составляет: нефти 0,4 г/л, вазелинового-масла 0,2 г/л, смазочного масла 8,3 мг/л, дизельного топлива 19,5 мг/л, нефти + + о-ксилола 33,3 мг/л, дизельного топлива + о-ксилола 20 мг/л в 1. сут. Эффект деструкции азокрасителей со-- ставляет: красителя красного 2 мг/л, оранжевого 1,04 мг/л, желтого 3,12 мг/л в 1 ч. Новый штамм способен расти в средах с содержанием NaCl 3-12% и рьппе, устойчив к солям тяжелых металлов. 12 табл. (Л
Концентрация,
+ + + + + +
+
ль
+
16,6 мг/л,в ч 33,3 мг/л в сут 0,2 г/л в сут 8,2 мг/л в сут 19,5 мг/л в сут
20 мг/л в сут
У/мл
+ +
Таблица 2
500 мг/лвсут 500 мг/л-150 ч
100 мг/л-80 ч
100 мг/л-96 ч
1395667
Субстрат для деструкции
Количество штамма и скорость деструкции Штаммы бактерий
PS. species 4-а
PS. specie
В-330
Деструкция ксенобиотиков
Класс Азокрасителей
моноазокраситель: кислотный красный (red С-6 с.с)
диазокраситель:прямой /субстантивнбй/ /желтьй - Sunchromin
тетраазокраситель: прямой ярко- оранжевый - Orange
Нефть
450 400
10 Продолжение табл.2
PS. species
В-330
Micrococcxis sp. IM
200 мг/л-144 ч
200 мг/л-30 сут
Таблица 4
27 24
98 99
II
1395667 2
Продолжение табл.4
350
21
100
Таблица 5
мазочное масло
1Г
и
ч и It
и It
It tt „
450 400 350 300 250 200 150
100
50
2Й 2275 мгУл
300
250
200
150
100
50
25 2275 мг/л
18 сут 12 сут
06 сут 3 сут 9 мес
98
99 100 100 100 100
100
100
100,
100
100
Таблица 7
15 13
10
7,5
5
2,5
1,3
15,3сут 3,5 мес
100 100
100
100 100
100
100
100
Дизельное топливо- tf-ксилол
Т a б л и ц а 8
Таблица 9
17
1395667
18 Таблица 10
Таблица П
Таблица 12
| Авторское свидетельство СССР № 1307846, кл | |||
| Способ гальванического снятия позолоты с серебряных изделий без заметного изменения их формы | 1923 |
|
SU12A1 |
