Способ получения конъюгированных антигенов Советский патент 1984 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к иммунохимии, а именно к способу получения конъюгированных антигенов морфин-антигенный носитель, которые могут найти применение в медицине и биологии для получения антител к морфину и родственным ему соединениям, нейтрализации их токсического и фармакологического эффекта, а также для определения опиатов в жидкостях и тканях организма.

Известны способы получения конъюгированных антигенов .морфин-антигенный носитель, согласно которым обычно получают реакционноспособное производное морфина, которое затем ковалентно связывают с антигенным белковым носителем, например сывороточными белками.

Известен способ получения конъюгированных антигенов на основе морфина путем сочетания морфина с диазониевой солью п-аминофенилацетамида, выделения полученного азопроизводного .морфина и гид ролиза его с получением .морфиназофениламина, который зате.м с по.мощью производного карбодиимида ковалентно связывают с бычьим сывороточным альбумином. Полученный конъюгированный антиген выделяют известными способами 1.

Недостаткам такого способа являются .многостадийность и трудоемкость.

Наиболее близким к нредлагаемо.му является способ получения конъюгированных антигенов на основе морфина, предусматривающий взаимодействие морфина с монодиазотированным бензидином с выделением полученного производного, его диазотированием и связывание.м с антигенны.м белковым носителем при рН 7-9. Обычно в качестве антигенного белкового носителя используют бычий сывороточный альбумин и соотношение производного морфина и белкового носителя составляет 1:(2-10) 2.

Недостатка .ми этого способа являются длительность и трудоемкость процесса получения конъюгированных антигенов на основе морфина. Реакционноспособное производное морфина получают в несколько стадий, при этом исходная молекула морфина значительно изменяется за счет введения дополнительных химических группировок, что в дальнейшем сказывается на специфичности антител. Необходима также стадия выделения и очистки промежуточных производных, применение в ходе синтеза растворителей, концентрированных солей и щелочей, а также токсичных веществ (бензидин).

Цель изобретения - упрощение процесса получения конъюгированных антигенов.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения конъюгированных антигенов на основе морфина при рН 8-9 осуществляют взаимодействие морфина.

антигенного белкового носителя и феррицианида калия при соотношении 1:С2-10) :1.

В предлагаемом способе конъюгированный антиген морфин-антигенный носитель получают в одну стадию. В реакцию связывания с антигенным носителем вступает реакционноспособное производное морфина -соответствующийфеноксирадикал морфина, который образуется при взаи.модействии морфина с феррицианидо.м калия.

Способ осуществляется следующим образом.

Водный раствор хлоргидрата инкубируют с равным весовым количеством феррицианида калия в присутствии раствора бычьего сывороточного альбу.мина в течение 1-2 ч при рН 8-9 и 0-25°С при соотношении морфин: антигенный носитель: феррицианИд калия 1: (2-10):1.

Полученный конъюгированный антиген морфин-антигенный носитель отделяют от низкомолекулярной фракции гель-фильтрацией на сефадексе G-25. Содержание морфина в синтезированном конъюгированном антигене определяют по разнице введенного в реакцию и непрореагировавщего морфина известным способом. В зависимости от соотношения исходных реагентов получают конъюгированные антигены, в которых с одной молекулой антигенного носителя (бычьего или человеческого сывороточного альбумина) ковалентно связаны от 11 до 20 молекул морфина. Структура полученных конъюгированных антигенов подтверждена данными УФ-спектров, в которых по сравнению со спектром исходного белка увеличивается интенсивность поглощения и смещение .максимума за счет присоединившихся к белку молекул морфина.

Соотношение исходных компонентов (1:10:1 -1:2:1) в реакции конъюгирования вы.брано в таких пределах, что получают конъюгированный антиген оптимального качества, т. е. содержащий от 11 до 20 молекул морфина на молекулу белка. При меньшем количестве морфина в конъюгированном антигене ухудшаются его антигенные свойства, при замещении больщем, чем,20 молекул морфина на моль белка, ухудщается растворимость конъюгированного антигена. Выбранный интервал рН (8-9) позволяет проводить реакцию с достаточной скоростью при стабильности белкового антигенного носителя.

В предлагаемом способе по сравнению с известным достигается значительное упрощение технологии (проведение технологии в одну стадию, без очистки и выдатения промежуточных продуктов. исключение целого ряда реактивов и растворителей, убыстрение процесса примерно в 20 раз). Это стало возможным в результате ис3 11237 пользования другого приема получения реакпионноспособного производного морфина и другого типа реакционноспособного производного. Установлено, что антигенные свойства, полученного продукта не уступают свойствам конъюгированны.х антигенов, полученных известным способом. Пример 1. К раствору 10 мг феррицианида калия в 0,5 мол воды добавляют раствор 10 мг хлоргидрата морфина в 1 мл воды и раствор 100 мг бычьего сывороточного, альбумина в 2 мл воды. Полученную реакционную смесь выдерживают в течение 2-х ч при 25°С, поддерживая рН 8 добав- j лением 10%-ного раствора гидроокиси натрия. Реакционную массу хроматографируют на колоннах с сефадексо.м G-25 и собирают белковую фракцию. Спектрофотометрически устанавливают, что в конъюгированном антигене морфин-бычий сывороточный аль20 бумин с одной молекулой белка ковалентно связаны 11 молекул морфина. Пример 2. По указанной методике при использовании в качестве антигенного носителя человеческого сывороточного аль-25 бумина получают конъюгированный антиген .морфин-человеческий сывороточный альбумин, в котором с одной молекулой альбумина ковалентно связаны 13 молекул морфина. Пример 3. К раствору 10 мг феррициани-30 да калия в 0,5 мл воды добавляют раствор 10 мг хлоргидрата морфина в 1 мл воды и раствор 20 мг бычьего сывороточного аль бумина в 2 мл воды. Полученную реакционную массу выдерживают при 10°С в течение 1 ч, поддерживая рН 9 добавлением 10%-ного раствора едкого натра. Реакционную массу хроматографируют на колонках с сефадексом G-25 и собирают белковую фракцию. Спектрофотометрически устанавливают, что в конъюгированном антигене40 морфин-бычий сывороточный альбумин с одной молекулой белка ковалентно связаны 20 .молекул морфина. 4д Пример 4. По указанной методике при использовании в качестве антигенного носителя человеческого сывороточного альбумина получают конъюгированный антиген морфин-человеческий сывороточный альбумин, в котором с одной молекулой белка ковалентно связаны 22 молекулы морфина, Антигенные свойства конъюгированного антигена морфин-белок, полученного в примере 1, исследовали на кроликах. Для этого 5 кроликов массой 2 кг иммунизировали конъюгированным антигеном морфин-белок внутримышечно по 25 мг/кг 2-3 раза в неделю в течение 6 недель (аналогичным образом проводилась иммунизация и в известном способе). В сыворотке крови животных определяли наличие антител к морфину реакцией пассивной гемагглютинации и торможения пассивной гемагглютинации, как и в способе-прототипе. Было установлено, что в сыворотке крови им.мунизированных кроликов имеются антитела на весь конъюгированный антиген, приче.м их титры были высокими и составляли в зависимости от индивидуальности животного 1:2560-1: ;10240. При введении в реакционную среду морфина в концентрации М, титр антител снижается до 1:128 - 1:256. Следовательно, полученный конъюгированный антиген морфин-белок обладает антигенными свойствами, так как он индуцирует у животных синтез антител, специфичных к морфину. Антигенные свойства полученного конъюгата не уступают, а даже в некоторой степени превосходят антигенные свойства конъюгата, полученного в известном способе, так как там были получены титры антител на весь конъюгат 1:2560, а при добавления морфина он снижается до 1:320. Технико-экономическая эффективность от ,использования предлагаемого изобретения заключается в упрощении процесса получения конъюгированны х антигенов на основе морфина, который проводится в одну стадию и не требует использования такого токсичного вещества как бёнзидин.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГИРОВАННЫХ АНТИГЕНОВ на основе морфина при рН 8-9, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, осуществляют взаимодействие морфина, антигенного белкового носителя и феррицианида калия при соотношении 1: