Способ определения аденозинтрифосфата Советский патент 1988 года по МПК G01N33/534 

4

оо со ел

Изобретение относится к области л муноанализа биологически активных веществ и может найти применение в биохимии, молекулярной биологии ив производстве меченых фосфором-32(33 аденозинтрифосфатов.

Целью изобретения является повышение точности способа за счет повышения чувствительности способа.

Пример 1. Получение конъ- югата антигена с бычьим сывороточным альбумином.

8-Вг АДФ и гексаметилендиамин АДФ получают следунндим образом,

500 мг динатриевой соли АДФ в 10 мл Ш Na-ацетатного буфера (рН 4,3) обрабатьшают избытком Вг в течение 40 мин. Избыток Вг2 экстрагируют хлороформом, а для удаления осTciTKOB Вг водный раствор обрабаты- вгиот 2 мг метабисульфита натрия. Продукт осаждают добавлением 3-4 объемов этилового спирта при -20°С. Осадок отфильтровьшают и промывают о5У1а денным спиртом, растворяют в 10 мл воды и добавляют 2 г гексаметилен- диамина. Смесь нагревают при 60-70° в течение 2,5-3 ч. Для освождения от избытка гексаметилендиамина про- дукт осаждают спиртом. Осадок промывают центрифугированием, растворяют в воде и хроматографируют на ДЭАЭ-сефадексе А-25 в аммонийбикар- бонатном буферном растворе, рН 7,5.

Для получения модифицированного 5 , 5 -диаденозинтетрафосфата (РАр4А) гексаметштендиаминовое производное АДФ вводят в реакцию кон- денсации с активированным АДФ. 0,06 моль триэтиламмонийной соли 5 -АДФ сушат упариванием Зк мл безводного ацетонитрилаJ растворяют в 1,2 мл смеси диметилсульфоксид - зтиловьт спирт (1:1 по объему) и добавляют 0,3 ммоль 4-диметиламико- пиридина, 0,24 ммоль трифенилфосфи- на, 0,24 ммоль дипиридилдисульфвда (PyS)i Смесь вьщерживают при комнатной температуре в течение 20 мин (смесь I) Выход 4-диметиламиноп1фИ- диниевого производного определяют тех на Kieselgel GO, F2f4 предварительно разбавляя аликвоту реакционной смеси 10%-ным раствором пиперидина в этиловом спирте и анализируя получающийся устойчивый пиперидид , Rf АДФ-0,05, Rf пиперидида .ЦФ-0,3.

0 5 о

Q j

5

Отдельно высушивают 0,077 ммоль триэтиламмонийной соли 8-(б-амино- гексаметш1ен)-аминоаденозин-5 -ди- фосфата добавлением и упариванием 3x1 мл ацетонитрила, растворяют в 800 мкл безводного диметилсульфокси- да, переносят в смесь I, упаривают этиловый спирт и проводят реакцию при в течение 2 ч. К смеси добавляют 10 мл смеси вода-дйметилсуль- фоксид (1:1) и наносят на колонку с ПЭИ-целлюлозой НСОа-форма,( мм), Колонку промьюают 50 мл смеси вода- диметилсульфоксид (I:), 50 мл воды, и выделение продукта проводят в градиенте концентрации ТЭАБ от О до 0,5 М {объем раствора 800 мл, скорость этаоции 40 М.Т1/Ч, объем фракций 15 мл) . Выход продукта составляет 65% относительно исходного АДФ. По- лученньй продукт по времени элюции ионообменной смолы, устойчивости к щелочной фосфатазе, соотношению основание .фосфат (1:2) и спектральным характеристикам в УФ-свете (

290 267 им, 236 им, -g-JeO

0,58) соответствует гексаметилен- диаминовому производному Ару А.

Конъюгирование полученного соединения с ВСА проводят по известной методике (10). К 2 мл 0,2 М Na-фос- фатного буфера рН 7,5, содержаща- щего 20 мг ВСА и 20 мг производного Ар4.А, по каплям добавляют 1 мл 0,2%- ного раствора глутарового альдегида Б воде. Добавление диальдегида проводят в ледяной бйне, а затем реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч. Непрореагировавший глутаровый альдегид связывают добавлением избытка лкзи- на. Конъюгат очищают от низкомолекулярных примесей диализом. Содержание ЕАр4А в составе конъюгата определяют спектрофотометрически. Эпитопное число конъюгата равняется 25-27 молекулам диаденозинтетрафосфата на молекулу ВСА.

Пример 2. Получение антисыворотки и ее характеристика.

Для иммунизации используют кроликов весом 1,5-2,0 кг. Антиген - конъ- югат ВСА с 5, 5 -диаденозинтетрафос- фатом {ВСА-К--Ар4А) в количестве 1 мг растворяют в 0,5 мл физиологического раствора и nepefl, , имьгунизацией смешивают с 0,5 мл адъюванта Фрейнда до

3I/,

образования однородной эмульсии. Полученный препарат вводят подкожно в несколько точек спины кролика. Первую инъекцию проводят с применением полного адъюванта Фрейнда. Спустя.2,4 и 8 нед. повторные инъекции проводят с использованием неполного адъюванта Фрейнда. Иммунизация животными пере- нчэсится хорошо. Через 9-10 дн, после четвертой инъекции забирают кровь тотально и получают антисьшоротку известным путем.

Титр антисыворотки, выраженньй в виде концентрации центров связьтания антигена Q, и .аффинитет антител к антигену в виде константы ассоциации К,,, определяют в эксперименте по связыванию -j. - Pj АТФ антителами из разбавленной антисьгаоротки путем представления полученных данных в координатах Скэтчарда.Реакцию проводят в буферном растворе, содержащем 50 мМ трис-HCl, 4 мМ ЭДТА (рН8,2) К одному и тому же количеству антисыворотки (конечное разбавление 1: i 20) добавляют различные количества y-3ipj дтф известной молярной радиоактивности и доводят с помощью буферного раствора объем во всех пробах до 100 мкл. Смесь инкубируют при А С в течение часа. Разделение связавшегося в комплекс с антителами и свободного АТФ осуществляют с помощью суспензии активированного угля, покрытого декстраном. После центрифугирования (2 мин, 6000 g) определяют радиоактивность супернатанта и рассчитывают количество АТФ,включившегося в комплекс антиген-антитело.

Пример 3. Определение количества АТФ.

Все реагенты готовят на буферном растворе, содержащем 50 мМ трис-НС1 и 4 мМ ЭДТА (рН 8,2) у, АТФ высокой молярной радиоактивности (V6000 Ки/ммоль) добавляют в пробы, содержащие известные возрастающие количества нерадиоактивного АТФ (5, 10, 15, 20 и 25х10 ь моль). В параллельной серии пробы содержат неизвест ные количества АТФ. Одна из проб не содержит намеченный АТФ (проба сравне ния). Объем всех проб доводят буферным раствором до 150 мкл с учетом анти- сьшоротки (разбавление 1:120), которую добавляют во все пробы в последнюю очередь. Пробы перемешивают встря хиванием и инкубируют при 40 С в те9508

чение 2 ч. Далее во все пробы, кроме гфобы сравнения, добавляют по 50 мкл суспензии активированного угля, покрытого декстраном, перемешивают и центрифугируют при 6000 g в течение 10 мин. По 75 мкл супернатанта из каждой пробирки растворяют в 1 мл воды и считают на жнцкос.тно-сцинтил0 ляционном счетчике Mark- 1J.

Предлагаемый способ определения АТФ прост в исполнении Для вьтолне- ния серии анализов требуется всего несколько мкКи фосфора-32(33). Позто5 му способ может быть осуществлен в любой биохимической лаборатории. Благодаря высокой чувствительности способа необходимое .для анализа количество фосфора-32 настолько мало,

0 что в совокупности с коротким периодом полураспада делает работу безопасной для здоровья персонала и исключает радиоактивное загрязнение лаборатории. В настоящее время налажен

5 регулярный промьшшенный вьтуск Р АТФ высокой молярной активности, и, следовательно, эта метка широко дос тупна.

Способ найдет применение прежде

0 всего для технологического контроля качества продукции - для определения молярной радиоактивности нуклеозид- трифосфатов высокой Удельной активности. Ранее для определения этой ха5 рактеристики продукции изотопного синтеза требовалось не менее нескольких мКи Р НТФ. Регулярное прове- , дение таких анализов дорого и требует принятия специальных мер для за0 щиты персонала от облучения.

В области биохимического анализа предлагаемый способ делает возможньм измерение содержания зтого биологически важного нуклеотвда в масштабе

45 отдельной клетки и его внутриклеточного распределения.

По предлагаемому способу чувствительность анализа определяется Q как %10 моль/пробу, а по известному 3 1 О моль/пробу. Специфичность, определяемая по величине 50% ингибироваг ия антител с .-АТФ, по предлагаемому способу опре- eg деляется 1,6%, а по известному - О,3%.

Формула изобретения

Способ определения аденочинтри- фосфата 5 включающий имьгунизащ-оо жи514395086

вотного гаптеном, ковалентно связан-чувствительности и специфичности раным с бычьим сывороточным албумином,диоиммунного анализа, в качестве

забор крови, вьщеление антисьторот-гаптена для иммунизации используют

ки, инкубирование ее с анализируе-8-(6-аминогексил)-5,5 -диаденозин

мой пробой в присутствии меченоготетрафосфата, в качестве меченого

аналога аденозинтрифосфата, разделе-аналога аденозинтрифосфата испольние связанного и свободного адено-зуют tc(j ) - 32(33) Р аденозинтризинтрифосфата и определение коли-фосфата и разделение связанного и чества аденозинтрифосфата по радио- свободного аденозинтрнфосфата осуактивной метке, отличающий-ществляют путем адсорбции на актис я тем, что, с целью повьшениявированном угле, покрытом декстраточности способа за счет повышенияном.

Изобретение относится к иммуно- анализу биологически активных ве- шеств и может найти применение в биохимии, молекулярной биологии и производстве меченых фосфором-32(33) аденозинтрифосфатов. Цель изобретения - повьпяение точности способа за счет повышения его чувствительности. Иммунизируют животных конъюгатом производного 5,5-диаденозинтетрафос- фатп с бычьим сывороточным альбумином. Получаемую антисыворотку инкубируют с анализируемой пробой в присутствии -у-- р АТФ, разделяют связанный и свободный АТФ адсорбцией на активированном угле, покрытом дек- страном. Определяют количество АТФ в пробе с использованием калибровочного графика, построенного по эталонным ,9 пробам с известным содержанием АТФ. Чувствительность способа 5-1 О моль/мл АТФ. (Л