Способ культивирования вируса висна-мэди Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к лабораторной диагностике висна-мэди овец, и может быть использовано для первичного выделения, идентификации, титрования вируса висна-мэди, накопления антигена при получении диагностических препаратов, а также сохранения антигенных и иммуногенных свойств вируса.

Целью изобретения является повышение выхода вируссодержащего материала, упрощение и удешевление способа.

П р и м е р 1. Для получения культуры клеток используют клинически здоровых, хорошо развитых ягнят 1-15-дневного возраста. Баранчиков кастрируют в хозяйстве открытым способом по общепринятой методике. Стерилизацию проводят в первой половине рабочего дня. Ягненка фиксируют спинкой вниз. Кожу мошонки дезинфицируют, стерильными ножницами вскрывают мошонку, захватив анатомическим пинцетом, подтягивают один из тестикулов, перевязывают стерильной шелковой нитью семенной канатик и отрезают его. Так же получают второй тестикул.

Извлеченные тестикулы помещают в стерильный флакон, содержащий 100-150 мл среды Хенкса с антибиотиками (пенициллин 500 ЕД/мл, стрептомицин 500 мкг/мл) и доставляют в лабораторию.

После доставки материала тестикулы тщательно (4-5 раз) промывают раствором Хенкса с антибиотиками, переносят в чашку

О

ел о

-N vj

СЛ

Петри, удаляют белочную оболочку и патологически измененные участки, разрезают тестикулы вдоль, вылущивают ткань и измельчают ее острыми ножницами до размеров частиц 1-3 мм. Измельченную ткань переносят в колбу для трипсинизации, промывают (4-6 раз) раствором Хенкса с антибиотиками для удаления обрывков ткани и эритроцитов.

Измельченную и промытую ткань заливают диспергирующей жидкостью (смесь 0,25%-ного раствора трипсина и 0.02%-но- го раствора версена в соотношение 9:1), подогретой до 37°С, после чего в колбу опускают стерильный магнит и ставят ее на магнитную мешалку, Дезагрегацию гкзни проводят дробно с интервалом 7-10 мин до полного истощения ткани при комнатной температуре. Для инактивации трипсина в полученную суспензию добавляют 5% сыворотки крови без консерванта. После каждого слива флакон с суспензией клеток помещают в холодильник. Взвесь клеток центрифугируют в течение 10 мин в рефрижераторной центрифуге при 800-1000 об/мин, надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в небольшом (30-50 мл) объеме подогретой до 37°С питательной среды, содержащей 0,5%-иый гидрализзт лактоальбумина на растворе Хенкса и среду Игла в соотношении 1:1 с добавлением 15- 20% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков.

Полученную концентрированную клеточную суспензию тщательно перемешивают и отбирают 0,2 мл для подсчета числа клеток в камере Горяева. Окрашивают 0,5%-ным водным раствором трипанового синего, выдерживают 5 мин и заряжают камеру Горяева.

Полученную при дезагрегации ткани концентрированную суспензию клеток разводят ростовой средой до 250-300 тыс. клеток в 1 мл. При трипсинизации одной пары тестикул ягнят 1-15-дневного возраста получают 110-140 млн живых клеток.

Посевы культур клеток проводят в пробирки и матрасы, делают отметку верхней поверхности засеянных сосудов с указанием наименования ткани и даты посева, помещают в термостат при 37°С в горизонтальном положении. Через 18-24 ч инкубирования образуются островки клеток различной величины. Через 24-48 ч для под- держаня роста клеток проводят смену ростовой среды. Ростовую культуру помещают в термостат при 37°С. Сплошной монослой клеток тестикулов ягнят 1-15-дневного возраста образуется на 3-5 сут. Жизнеспособность клеток 90-95%.

Пересев клеток осуществляют после образования сплошного монослоя, Для этого из матраса с выросшим монослоем клеток удаляют питательную среду, монослой промывают стерильным раствором Хенкса с антибиотиками (пенициллин 100 Ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл) для освобождения от сыворотки, после чего вносят подогретую до 37°С смесь растворов версена

0,02% с трипсином 0,25% в соотношении 9:1. После смачивания монослоя половину жидкости сливают, матрасы помещают в термостат на 5-10 мин при 37°С. После отделения клеток от стекла во флаконы вносят

питательную среду с добавлением 10-15% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков. Сыворотку предварительно инак- тивируют при 5о°С в течение 30 мин, Полученную суспензию клеток пересевают

бесцентрифужным способом с коэффициентом пересева 1:1,5-1:2.

При субкультивировании используют концентрацию клеток 200-250 тыс,/мл. Монослой формируется через 3-5 сут.

Первично трипсинизированные клетки

тестикулов ягнят но обнаруживают резких различий по структуре монослоя и представлены клетками эпителио- и фибробластоло- добного типз. На окрашенных препаратах

эпителиоподобные клетки имеют полигональную форму, границы клеток плотно примыкают друг к другу. Ядро клеток крупное, округлой формы с ядрышками. Количество ядрышек от 3 до 5, реже больше.Хроматин

ядра имеет крупносетчатую структуру, цитоплазма - с мелкой вакуолизацией. Фиб- робластоподобные клетки имеют форму веретена или вытянутой пирамиды, удлиненное ядро и многочисленные ядрышки.

Митомический индекс в культурах подсчитывают по общепринятой методике, Величина митотического индекса в культуре клеток тестикулов ягнят 1-15-дневного возраста изменяется от 12,4% а первые дни

культивирования до 25,5% на 3-4 сут роста. Средний митотический индекс составляет 22-25%.

П р и м е р 2. Перед заражением моно- слойные культуры клеток просматривают макро- и микроскопически. Макроскопически среда в культуральных сосудах должна быть прозрачной, иногда с легкой опалес- ценцией, красновато-розового цвета; мик- роскопически культура должна покрывать культуральную поверхность стекла сплошным пластом с преобладанием эпителиогю- добных клеток.

Заражение культур клеток проводят следующим образом.

Ростовую среду из сосудов сливают, мо- нослой клеток отмывают от сыворотки, ополаскивая его трижды раствором Хенкса с антибиотиками, вносят 10%-ную суспензию вирусосодержащего материала в объеме 20% от количества питательной среды, оставляют на 2-3 ч для контакта при 37°С. После этого матрас освобождают от внесенной суспензии и заливают в него поддержи- вающую среду. Инкубируют в течение 24-48 ч при 37°С.

Для ускорения проявления цитопатиче- ского действия вируса, повышения титра его накопления проводят повторное внесе- ние в сосуд с культурой клеток вирусного материала. Для этого культуру клеток тести- кулов ягненка освобождают от питательной среды, вносят 10%-ную суспензию вирусосодержащего материала, оставляют на 2-3 ч при 37°С. После этого удаляют суспензию из матрасов и вносят поддерживающую среду. Инкубируют при 37°С.

Вирус висны-мэди репродуцируется с проявлением цитопатического действия, началом которого в семенной клеточной культуре считают образование округлых и веретенообразных одноядерных клеток, затем многоядерных симпластов, которые на неокрашенных препаратах выглядят как звездчатые гигантские клетки с большим ко- личествпм отростков. Характерной чертой поликариоцитов в инфицированной культуре клеток является концентрирование ядер в розетки. Наиболее характерные признаки

цитопатического действия при выделении вируса зисны-мэди из патологического материала от больных овец (кусочки легких, мозга, региональные лимфатические узлы, кровь) отмечают на 4-6 пассажах. При заражении вирусом висны-мэди клеточной культуры тестикулятов ягнят 1-15-дневного возраста вновь синтезированный вирус обнаруживают на 42 ч после инокуляции. Титр вируса возрастает к 60 часу и достигает максимального значения на 120 ч после инокуляции. Титр вируса висны-мэди составляет 10 6 5ТЦД50/Мл.

Примерз. Данные, касающиеся чувствительности культур клетоктестикулов ягнят з зависимости от возраста, приводятся в табл.1.

П р и м е р 4. Сравнительные данные средних величин основных показателей эффективности данного и известных способов культивирования вируса висны-мэди приводятся в табл. 2.

Формула изобретения Способ культивирования вируса висна- мэди, включающий внесение вирусного материала в культуру клеток, выращиваемую на питательной среде, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода вирусосодержащего материала, упрощения и удешевления способа, в качестве культуры клеток используют тестикулы ягнят 1-15- дневного возраста, а внесение вируса осуществляют двукратно с интервалом 24-48 ч.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к лабораторной диагностике вируса висна-мэди овец, и может быть использовано для первичного выделения, идентификации, титрования вируса висна-мэди, накопления антигена при получении диагностических препаратов, а также сохранения антигенных и иммуногенных свойств вируса. С целью повышения выхода вирусосодержа- щего материала, упрощения и удешевления способа вирус культивируют в культуре клеток тестикулятов ягнят 1-15-дневного возраста, с использованием питательных растворов - 0,5%-ного гидролизата лакто- .альбумина на растворе Хенкса и среды Игла в соотношении 1:1, а заражение культуры клеток вирусосодержащей суспензией осуществляют дважды с интервалом 24-48 ч. 2 табл.

Таблица 1

Чувствительность культуры клеток тестикулов ягнят в зависимости от возраста

Выход клеток Жизнеспособность, % Средний митотический индекс, %

Время формирования монослоя, сут. Структура монослоя

Титр вируса, ТЦЦ50/М

10

70-100 50-60

12-13

10

3-56-7

Смешанного типа с Смешанного типа с преобладанием эпи-преобладанием эпи- телиоподобных телиоподрбных 10-6,5to4 -

Таблица 2

Сравнительная эффективность предлагаемого и известных способов культивирования вируса висны-мэди

1-4-10 30-50

6-8

70-75-10 80-87

18

7-104-5

Фибробластопо- Смешанного типа с добного типа преобладанием фиб- робластоподобных

10

.,-5,0-6,0

10

Образование округлых и веретенообразных одноядерных клеток, а также многоядерных симпластов, которые на неокрашенных препаратах выглядят как звездчатые гигантские клетки с большим количеством отростков. Ядра поликарциоцитов концентрируются в розетки

110-140-10 90-95

22-25

3-5

Смешанного типа с преобладанием эпителиоподобных

10

6, Г