СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭПИТЕЛИОПОДОБНЫХ КЛЕТОК ЛЕГКОГО ПЛОДА БУЙВОЛИЦЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ Российский патент 2013 года по МПК C12N5/73 A61L27/38 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения культур клеток, и может быть использовано в ветеринарной вирусологии при диагностике вирусных инфекций крупного рогатого скота.

В настоящее время накоплено много материалов, свидетельствующих о том, что оптимальными клеточными системами при получении вирусных препаратов и для экспериментальных целей являются культуры диплоидных клеток. Диплоидные культуры имеют ряд преимуществ перед первичными и постоянными (стабильными) культурами, так как они способны длительно размножаться in vitro с сохранением исходных свойств, однородны по клеточному составу и свободны от контаминантов [2, 4].

Известны диплоидные культуры клеток, полученные из различных тканей: почек, кожи, легкого, сердца, селезенки, гимуса, щиговидной железы и других органов разных видов животных и человека [1-7].

Недостатком известных способов является их сложность, которая заключается в ферментативной и механической обработке исходного материала, что требует много времени, вызывает потери клеток, а использование химических реагентов нарушает функции клеток. Кроме того, культуры, полученные по прототипам ферментативной дезагрегации ткани, были фибробластоподобного тина. Известно, что диплоидные клеточные культуры фибробластоподобного типа имеют ограниченный срок жизни при культивировании in vitro и чувствительность их к вирусам ниже, чем к клеткам эпителиоподобного типа.

Наиболее близким к предлагаемому способу по технической сущности и достигаемому результату является способ культивирования фибробластов для заместительной терапии, описанной в патенте RU 2320720 [6]. В данном способе предлагается вводить охарактеризованную культуру фибробластов, предназначенную в качестве средства для регенеративной терапии и косметологии. Недостатком способа является «жесткая» обработка первичного материала (инкубация с протеазами животного происхождения при постоянном перемешивании и пипетировании), которая является травматичной для клеток процедурой, снижающей общее количество жизнеспособных клеток в получаемой суспензии дермальных фибробластов, а также приводящей к нарушениям адгезивной и рецепторной систем у части сохранивших жизнеспособность клеток.

Настоящее изобретение представляет собой разработку, в которой предпринята попьлка получения эшпелиобластов из легочною экспланта плода буйволицы, чувствительных к респираторным вирусам КРС, с использованием технологии получения культуры клеток, не требующей ферментативной и механической обработки исходного материала и культивирования клеток без пересева.

Целью изобретения является получение эпителиоподобных клеток легкого плода буйволицы (ЛПБ), чувствительных к широкому спектру респираторных вирусов крупного рогатого скота (КРС).

Технический результат, достигаемый предлагаемым способом, заключается в упрощении получения клеток эпителиоподобного типа, обладающих интенсивным размножением и чувствительностью к респираторным вирусам КРС.

Для достижения указанного технического результата в способе получения эпителиоподобных клеток, включающем получение эксплантов, инкубирование в питательной среде и выделение эпителиобластов, осуществляют из ткани легкого без ферментативной и механической обработки. Для этого ткань легкого после получения в стерильных условиях разрезали на кусочки 3…5 мм³ и промывали до полного просветления надосадочной жидкости. Полученные экспланты, промытые стерильным раствором Хенкса с антибиотиками, помещали во флаконы Карреля, заливали питательной средой, состоящей из равных объемов 0,5%-ной среды гидролизат лактальбумина (0,5% ГЛА) со средой 199 с 10% сыворотки КРС и инкубировали при температуре 37°С. Через 48-72 ч с начала культивирования проводили смену среды. На 6-8 дни культивирования механически удаляли экспланты, а клетки из очагов роста снимали со стекла 0,02%-ным раствором версена, подогретого до 35-37°С и пересевали в соотношении 1:1. В дальнейшем культивировали клетки без пересева в течение трех недель, причем, через каждые 4-5 суток проводили смену среды на 30-50% с добавлением 0,5%-ного глутамина.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

Эпителиоподобные клетки ЛПБ получали следующим образом.

В качестве исходной ткани использовали легкое плода буйволицы на 3…5-м месяцах развития, доставленное не позднее 2-3 ч после убоя животного. В стерильном боксе у плода извлекали легкое и промывали стерильным раствором Хенкса с антибиотиками (200 ед./мл пенициллина и 200 мкг/мл стрептомицина). При обработке органа удаляли плевру, трахею, бронхи, крупные кровеносные сосуды, разрезали ткань на кусочки 3…5 мм³ и промывали до полного просветления надосадочной жидкости.

Кусочки предварительно измельченной ткани, промытой стерильным раствором Хенкса с антибиотиками, помещали в маленькие культуральные флаконы Карреля, на расстоянии 1-1,5 см друг от друга. Заливали флаконы питательной средой, состоящей из равных объемов 0,5% ГЛА со средой 199 с 10% сыворотки КРС, с помощью 10 мл пипетки так, чтобы экспланты были покрыты средой. Флаконы помещали при 37°С для выращивания в термостате.

У эксплантов через 24-48 ч отмечали очаги роста клеток, которые постепенно увеличивались. Колонии растущих клеток от эксплантатов были смешанного (энителиоподобного и фибробластоподобного) типа. Смену среды проводили через 48-72 ч с начала культивирования. В дальнейшем поступали с культурой следующим образом.

После того, как во флаконе появились очаги роста эпителиоподобных клеток (на 6-8 дни), механически удаляли экспланты, а клетки из очагов роста снимали со стекла 0,02%-ным раствором версена, подогретого до 35-37°С и пересевали в соотношении 1:1. Посевная концентрация клеток 300-350 тыс./мл. На 5-е сутки культивирования получали однородную культуру, состоящую преимущественно (с преобладанием 70-80%) из клеток эпителиоподобного типа. Такую культуру использовали в дальнейших экспериментах по выращиванию субкультур или эпителиоподобных культур того же типа.

В дальнейшем культивировали клетки без пересева в течение трех недель, причем, через каждые 4-5 суток проводили смену среды на 30-50% с добавлением 0,5%-ного глутамина.

В результате культивирования без пересева наблюдали постепенное отмирание оставшихся в культуре клеток фибробластоподобного типа и во флаконах оставались клетки эпителиоподобного типа, которые формировали колонии однородных клеток. В первых пассажах размножение клеток в колониях происходило медленно, и накопление клеток было достаточным для пересева в том же флаконе 1:1. Последующие пересевы делали в соотношении 1:2, концентрация клеток составляла 200-250 тыс. кл/мл.

Первые 3-4 пассажа монослой в культуре формировался в течение 2-3 недель. В это время каждые 4-5 дней проводили частичную смену среды на 30-50%. Культура стабилизировалась на 5-м пассаже. Последующие пассажи осуществляли по мере формирования монослоя, с помощью 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02%-ного раствора версена, в соотношении 1:9 безцентрифужным способом.

Полученная культура подвергалась субкультивированию много раз и к настоящему времени она представлена исключительно эпителиоподобными клетками. Культура прошла более 44 пассажей.

Морфологическая характеристика. Культура обладает интенсивным ростом. Через 6-8 ч культивирования отмечался активный рост однородных по составу клеток, которые росли в один слой без напластования. К 60-72 ч формируется монослой. Коэффициент пересева- 1:2.

Питоморфологический анализ препаратов на уровне 10, 20, 30 и 40 пассажей показал, что культура ЛЭБ представлена в монослое клетками эпителиоподобного типа. На окрашенных препаратах клетки имели полигональную форму, границы плотно примыкали друг к другу. Ядро клеток - крупное, округлой формы, с 3-5 ядрышками. Структура ядра имела мелкосетчатую гранулярную структуру.

При кариологическом анализе клеток штамма модальный класс хромосом составлял 2n=50.

Сведения о контаминантах. Бактерии, грибы и микоплазмы при бактериологическом, радиоавтографическом, цитологическом исследованиях с применением флюорохрома-оливомицина не обнаружены.

Культуральные свойства. Границы клеток хорошо выражены и культура хорошо пассируется. В качестве ростовой среды использовали: среду 199, 0,5% ГЛА + 199 или 0,5% ГЛА + Игла в равных соотношениях с добавлением 10% сыворотки КРС, инактивированной при 56°C в течение 30 мин и антибиотиков (100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина).

Монослой клеток ЛЭБ сохранялся в термостате при 36-37°С на среде без сыворотки - 12-15 дней, без признаков дегенерации.

Эпителиоподобная культура клеток ЛПБ нашла применение в работе при изучении вирусных респираторных инфекций КРС.

Описанный метод позволил надежно получить эпителнеподобную культуру клеток из ткани легкого плода буйволицы.

Пример 1. Культуру клеток ЛЭБ культивировали на среде 199 с 0,5% ГЛА в соотношении 1:1, с добавлением 10% сыворотки КРС и антибиотиков (100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). При пересеве клетки снимали со стекла 0,25%-ным раствором трипсина и 0,02%-ным раствором версена в соотношении (1:9), подогретым до 36°С. После подсчета клеток суспензию разбавляли до посевной концентрации питательной средой 200-250 тыс. кл/мл.

Культуральные матрасы помещали в термостат при 37°С. Монослой формировался через 48-72 ч. Культуру с выросшим монослоем использовали для заражения вирусом инфекционного ринотрахеита (ИРТ).

Пример 2. Культуру клеток ЛЭБ культивировали на среде Игла с 0,5% ГЛА в соотношении 1:1, с добавлением 10% сыворотки КРС. После формирования монослоя через 48-72 ч культуру использовали для заражения вирусом парагриппа-3 (ПГ-3).

Пример 3. Культуру клеток ЛЭБ культивировали на среде 199, с добавлением 10% сыворотки КРС. После формирования монослоя через 48-72 ч культуру использовали для заражения вирусом вирусной диареи-болезни слизистых оболочек (ВД-БС).

Пример 4. Культуру клеток ЛЭБ культивировали на среде 199 с 0,5% ГЛА в соотношении 1:1 с добавлением 10% сыворотки КРС. После формирования монослоя через 48-72 ч культуру использовали для заражения вирусом аденовирусной инфекции крупного рогатого скота (АДВИ).

Для выявления чувствительности культуры к вирусам проведено пять последовательных пассажей вирусов. Установлено, что культура ЛЭБ чувствительна к указанным вирусам. Цитопатогенное действие (ЦПД) вируса ИРТ наступало через 30 ч после заражения и характеризовалось округлением клеток, разрыхлением и разрушением монослоя с последующим отторжением клеток от стекла. В зараженной культуре отмечали также маргинацию хроматина в ядрах, затем (через 25-30 ч) - формирование внутриядерных включений, характерных для вирусов группы герпеса. ЦПД вируса ПГ-3 наступало через 48-72 ч. Изменения в культуре, вызываемые вирусом, характеризовались появлением многоядерных клеток (симпластов) и постепенным, через 72-96 ч, разрушением монослоя. В цитоплазме клеток наблюдали окрашенные в розовый цвет цитоплазматические включения разной величины. Иногда они занимали почти всю цитоплазму, в ряде случаев в ядрах клеток выявляли мелкие розовые включения, окруженные светлой зоной. Титр вируса ИРТ достигал 10^5,5-7,0 ТЦД₅₀/мл, вируса НГ-3 - 10^6,25-6,6 ТЦД₅₀/мл.

Культура клеток ЛЭБ также чувствительна к вирусам ВД-БС и АДВИ с характерным выражением ЦПД. Для вируса ВД-БС характерно появление в клетках околоядерных вакуолей, пикноз ядер и клеток, на протяжении всей инфекции - вакуолизация цитоплазмы. При заражении адсновирусом полная дегенерация монослоя сопровождалась симпластообразованием, которое наблюдалось через 36-48 часов. Титр вирусов ВД-БС и АДВИ в культуре достигал 10^4,75-5,4 ТЦД₅₀/мл и 10^5,25-5,5 TЦД₅₀/мл, соответственно.

При обследовании одной из вспышек респираторных инфекций КРС максимальное число выделенных вирусных агентов составило до 35% на первично-трипсинизированной культуре почки телят, а на культуре ЛЭБ - 42% по отношению к числу проб, использованных для исследования. Таким образом, культура также пригодна и для первичного выделения вирусов из патологического материала.

Как видно из примеров, полученная эпителиоподобная культура клеток ЛЭБ чувствительна к респираторным вирусам КРС.

В динамике культивирования проведена криогенизация в целях длительного сохранения клеток в криозащитной среде, состоящей из 50% сред 199 с 0,5% ГЛА в соотношении 1:1, 40% сыворотки КРС и 10% ДМСО. Проведено замораживание культуры на уровне 10, 20, 30-го пассажей. Через 15 и 30 дней храпения в жидком азоте (-196°С) культуры клеток ЛПБ провели ее размораживание и рекультивирование. Через 48-72 ч рекультивирования формировался монослой, представленный клетками эпителиоподобного типа, которые морфологически не отличались от исходной культуры.

Литература

1. Авторское свидетельство СССР №1147748 от 30.03.1985.

2. Дьяконов Л.Н., Ситьков В.И. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии). - М.: Компания Спутник⁺. - 2000. - 400 с.

3. Лисок Т.П., Шитикова Г.С., Пономарева Н.П. и др. Получение и характеристика диплоидных линий фибробластов легкого эмбриона человека / Этиология и диагностика гриппа и других острых респираторных заболеваний // Сб. научных трудов. - Л. - 19Х2. - C.110-116.

4. Осидзе Д.Ф. Получение культур клеток из тканей животных и их использование в вирусологии. - М. - 1975. - 103 с.

5. Панкова Г.Е., Сологуб В.К., Гололобова М.Т., Резова Т.И. Штамм диплоидных клеток легкого эмбриона лошади. Ветеринария. - 1978. - №3. - С.42-43.

6. Патент РФ №2320720 от 27.03.2008. 7. Поздняков А.А., Юров К.П., Мутузкина З.П. и др. Методика получения диплоидного штамма клеток тестикулярной ткани жеребят и испытание его чувствительности к некоторым вирусам. Бюллетень ВИЭВ. - 1976. - Вып.24. - С.46-48.

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной вирусологии. Предложен способ получения эпителиоподобных клеток легкого плода буйволицы путем длительного беспересевного культивирования, обладающих высокой чувствительностью к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, парагриппа-3, вирусной диареи - болезни слизистых оболочек и аденовирусной инфекции. Изобретение может быть использовано при диагностике вирусных инфекций. 4 пр.

Способ получения эпителиоподобных клеток легкого плода буйволицы для культивирования вирусов, в ходе осуществления которого экспланты размером 3-5 мм³, полученные из измельченной ткани, культивируют со сменой питательной среды через 48-72 ч с начала культивирования, через 6-8 дней экспланты удаляют и пересевают клетки, выросшие в очагах роста экспланта, оставшиеся после их удаления, снимая их со стекла 0,02%-ным раствором версена, подогретого до 35-37°C, отличающийся тем, что полученные клетки культивируют без пересева в течение трех недель со сменой среды через каждые 4-5 суток с добавлением 0,5%-ного глутамина.