Способ получения ганглиозидов Советский патент 1984 года по МПК G01N33/48 

00

4

00 Изобретение относится к медицине в частности к биохимии. Известен способ выделения гангли зидов, включающий экстрагирование ганглиозидов из нервных тканей млекопитающих тетрагидрофураном с последуняцим пропусканием экстракта через хроматографическую колонку и вы деление осадка, который растворяют в воде, диалнзуют и сушат сублимацией С13. Известен также способ получения ганглиозидов по Свеннерхольму, вклю чающий обезвоживание нервной ткани ацетоном, последующее ее экстрагирование смесью хлороформ-метанол с многократным фракционированием, вкл чающим в себя 18 этапов 121. Целью изобретения является ускоР ение и повышение безопасности способа. Указанная цель.достигается тем, что согласно способу,получения ганглиозидов путем гомогенизации мозговой ткани, обезвоживание ее, экст рагирования смесью хлороформа с органическим растворителем с последую щей ОЧИСТКОЙ целевого продукта, экс ракцию ведут смесью хлороформа с этанолом, а очистку проводят добавлением к пробе ацетона в соотношени 5:1. Способ осуществляют следующим образом. Отделяют серое вещество головног мозга от белого. Серое вещество гомогенизируют с ацетоном из расчета 4 мл на 1 г исходной ткани. Затем непрерывно перемешивают в течение 12-20 ч и фильтруют суспензию на во ронке Бюхнера. Осадок опять суспендируют в ацетоне из расчета 2 мл на 1 г ткани, перемешивают в течени 4 ч при и повторно фильтруют на воронке Бюхнера. Полученный осадок дважды экстраги руют смесью хлороформ-этанол tl:l из расчета 2 мл на 1 г исходной ткани. В течение 1 ч встряхивают на шуттеле и центрифугируют. Супернатан ты собирают, а осадок опять экстрагируют смесью хлороформ-этанол (1:11 из расчета 1 мл на 1 г исходной тка ни. Эту суспензию нагревают на водяной бане 30 мин при и центрифугируют в горячем виде. Супернатан ты объединяют. Добавляют к полученному экстракту 5 объемов ацетона. Смесь ганглиозидов выпадает в осадок. После полного формирования осадка (через 3040 мин супернатант отсасывают сифоном, а смесь ганглиозидов собираю Пример 1.В качестве источ ника получения ганглиозидов используют головной мозг свиньи. Отделяют серое вещество головного мозга от бе лого. Серое вещество в количестве 1000 г гомогенизируют в 4000 мл ацетона, затем непрерывно перемешивают в течение 12 ч при и суспензию фильтруют на воронке Бюхнера. ОС7.ДОК вновь суспендируют в 2000 мл ацетона и перемешивают в течение 4 ч при 20° С и повторно фильтруют на воронке Бюхнера. Для извлечения ганглиозидов полученный осадок экстрагируют 2000 мл смеси хлороформ-этанол(1:1) путем встряхивания на шуттеле в течение 1 ч при . Супернатант. собирают, а осадок вновь экстрагируют 1000 мл этой же смесью органических растворителей при 50°С в течение 30 мин и центрифугируют при данной температуре. Полученные супернатанты объединяют и для осаждения ганглиозидов добавляют к ним 5 объемов flSOOO млЧ ацетона. После полного Формирования осадка (через 30-40 мин супернатант отсасывают сифоном, а осадок, представляющий собой смесь различных ганглиозидов, окончательно освобождают от супернатанта центрифугированием. Полученный препарат ганглиозидов содержит 395+ 17 мг N-ацетилнейраминовой кислоты, определяемой с помощью резорцинового реактива, и 6122500 51500 токсиннейтрализующих единиц, выявляемых в тесте нейтрализации биологического действия холерогена в кожной пробе по методу рейга. В надосадочной жидкости, полученной после осаждения препарата ацетоном, ганглиозиды не обнаруживаются. Пример 2. В качестве источника получения ганглиозидов используют головной, мозг свиньи. Конкретное осуществление способа проводят, как описано в примере 1, использ-уя для осаждения ганглиозидов вместо 5 объемов ацетона 4 объема, что приводит к частичному выпадению ганглиозидов в осадок. Полученный препарат ганглиозидов содержит 211 i 13,5 мг N-ацетилнейраминовой кислоты, определяемой с помошьк) резорцинового реактива, и 3872000 i 32500 токсиннейтрализующих единиц, выявляемых в тесте нейтрализации биологического действия холерогена в кожной пробе по методу Крейга. В надосадочной жидкости, полученной после осаждения препарата ацетоном, обнаруживаются ганглиозиды, полностью осадить которые удается путем добавления к раствору ацетона до 5 объемов. Пример 3. В качестве истрчника получения ганглиозидов используют головной мозг свиньи. Конкретное осуществление способа проводят, как описано в примере 1, используя для осаждения ганглиозидов вместо 5 объемов ацетона 6 объемов, что не обеспечивает дополнительного осаждения ганглиоэидов, которые практически полностью осаждаются 5 объе- мами ацетона. Полученный препарат ганглиоэидов содержит 397 1 15 мг N-ацетилнейраминовой кислоты, определяемой с помощью резорцинового реактива, и 6124000 ± 49500 токсиннейтрализующих единиц, выявляе1 их в тесте нейтрализации биологического действия холерогена в кожной пробе по Крейгу. В надосадочной жидкости, полученной после осаждения препарата ацетоном, ганглиозидкл не обнаруживаются.

Пример 4. В качестве источника получения ганглиозидов используют головной мозг крупногорогатого скота. Конкретное осуществление способа проводят, как описано в примере 1. Полученный препарат ганглиозидов содержит 369 ±18 мг N-ацетилнейраминовой кислоты, определяемой с помощью резорцинового реактива, и 5897000 56500 токсиннейтрализующих единиц, выявляемых в тесте нейтрализации биологического действия холерогена в кожной пробе по методу

Крейга. В надосадочной жидкости, т-о ученной после осаждения препарата йцётоном, ганглиозиды не обнаруживаются.

Пример 5.В качестве источника получения ганглиозидов используют головной мозг барана. Конкретное осуществление способа проводят, как описано в примере 1. Полученный препарат ганглиозидов содержит 352 i 14 мг Ы-ацетилнейраминовой кислоты, определяемой с помощью резорцинового реактива, и 58630001 545000 токсиннейтрализующих единиц, выявляекых в тесте нейтргшизации биологического действия холерогена в кожной Ъробе по методу Крейга. В надоса дочной жидкости, полученной после осаждения препарата ацетоном, ганглиозиды не обнаруживаются. Таким образом, получение ганглиозидов предлагаемым способом проходит а 6-7 дней быстрее, чем по извест-. ному за счет введения осаждения ацетоном. Способ позволяет заменить использование сильнодействующего ядовитого растворителя метанола на этанол, что повышает безопасность получения целевого продукта.

СПОСОР ПОЛУЧЕНИЯ ГАНГЛИОЗИ.ДОВ путем гомогенизации мозговой ткани, обезвоживани ее, экстрагирования смесью хлороформа с органическим растворителем с последующей очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, экстракцию ведут смесью хлороформа с этанолом, а очистку проводят добавлением к пробе ацетона в соотношении 5:1.