СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВОЙ ПИЩЕВОЙ ДОБАВКИ Российский патент 1997 года по МПК A23J1/02 

Изобретение относится к биотехнологии получения белковой пищевой добавки из животного сырья, а именно к способам получения белковой добавки, которая может быть использована в пищевой промышленности и медицине.

Известно, что белковые продукты, получаемые из животного сырья, обладают высокой усвояемостью и содержат наиболее полный набор аминокислот и пептидов, необходимый для собственно питания и физиологической регуляции [1]
Вместе с тем традиционные кулинарные приемы обработки животного сырья (термообработка, консервирование, стерилизация) при изготовлении разнообразных пищевых продуктов приводят к полной денатурации нативной структуры белков и их комплексов с небелковыми компонентами нуклеиновыми кислотами и гликолипидами. Такие денатурированные вещества могут усваиваться только после полного энзиматического гидролиза до мономеров (аминокислот, моносахаров и др.) в желудочно-кишечном тракте [2]
При этом теряются ценные питательные свойства, которыми обладают нативные белки регулятора клеточной пролиферации и дифференцировки, например, гистоны (щелочные внутриклеточные белки) и кейлоны (кислые внутриклеточные белки). Кроме того, кулинарная обработка приводит к разрушению комплексов нативных внутриклеточных белков с нуклеиновыми кислотами (РНК и ДНК), которые используются клетками для ускорения биосинтеза веществ и для репарации ДНК при повреждении ее структуры.

Известен традиционный способ получения растительного белка из обезжиренной соевой муки [1, 3] Согласно этому способу соевую муку экстрагируют водным раствором щелочи при рН 8,0-9,5 при соотношении мука раствор 1:8-1:10 в течение 1-2 ч. После отделения осадка фильтрацией экстракт подкисляют соляной кислотой до рН 3,6-4,8; выпавший белковый осадок отделяют фильтрацией и сепарируют, промывают раствором соли с добавлением хлористого магния, сушат и используют для приготовления диетических продуктов или заменителей мяса.

Получаемые диетические белковые продукты из растительного сырья обладают определенными лечебными свойствами (снижение холестерина в плазме, профилактика диабета, общее снижение веса и др.). Белковые препараты из растительного сырья представляют собой алиментарные белки; при этом они плохо усваиваются, если не использовать их термообработку (варение, жарение, экструзию) для денатурации и частичного гидролиза [3] При этом небольшое количество термостойких компонентов, которые присутствуют в белковых продуктах из растительного сырья (немагглютинины, тиогликозиды, сапонины и танины), проявляют антипитательные свойства, так как являются чуждыми веществами для метаболизма животных организмов, в частности млекопитающих.

С этой точки зрения белковые продукты, получаемые из животного сырья, обладают более высокой усвояемостью, так как содержат более полный набор аминокислот и пептидов, необходимый для собственно питания и физиологической регуляции.

Известен способ получения биологически активных концентратов, в частности биологически активных концентратов из эндокринных желез животных (зобных или околоушных желез северного оленя) [4]
Согласно известному способу подготовленное (замороженное и измельченное) животное сырье подвергают экстрагированию водно-солевым раствором, нерастворимые вещества удаляют при температуре не выше 5^oС, а концентрирование экстракта проводят путем лиофильного высушивания.

Получаемый вышеописанным способом биологически активный концентрат представляет собой комплекс низкомолекулярных пептидов и может быть использован для выделения биологически активных веществ, таких как тимозин, тимопоэтины, тимусный фактор Х, тималин и ингибитор протеаз.

Целью изобретения является создание способа получения неуклеопротеинового комплекса, представляющего собой физиологически активные вещества нуклеопротеиновой природы, обладающие тканеспецифическим действием, которые при использовании в качестве пищевых добавок диетических дополнений к нормальному питательному рациону, проявляют укрепляющее и регулирующее действие на организм за счет непосредственной тканевой ассимиляции.

Это достигается способом получения нуклеопротеинового комплекса, предусматривающим экстракцию подготовленного животного сырья (измельченных замороженных органов и тканей млекопитающих) с использованием в качестве экстрагента 1-2,5%-ного раствора углекислого натрия (соды) при рН 10,4- 10,8 в течение 2-4 ч с добавлением 0,1-0,5%-ного хлористого магния при соотношении объемов экстрагируемой ткани и раствора соды в диапазоне 1:8-1:20, отделение осадка фильтрацией или на центрифуге, подкисление экстракта до рН 3,8-5,5, охлаждение образовавшейся суспензии при температуре не выше 4^oС в течение 40 ч для удаления нерастворимых веществ, промывание осадка органическими растворителями (последовательно этанолом, ацетоном, серным эфиром), высушивание осадка в вакууме при температуре не выше 55^oС.

Способ осуществляют следующим образом.

Исходное сырье после гомогенизации помещают в 1-2,5%-ный раствор углекислого натрия в дистиллированной воде при соотношении гомогената и раствора от 1: 8 до 1:20. Экстракцию проводят в присутствии хлористого магния в концентрации 0,1-0,2 г/л при постоянном перемешивании и контроле рН суспензии, который должен находиться в пределах 10,4-10,8. Через 4 ч надосадочную жидкость удаляют путем фильтрации через фильтр, например, бязь или плотный капрон. К полученному фильтрату постепенно и при постоянном помешивании добавляют 33%-ный раствор уксусной кислоты до установления рН 3,8-5,5. Для формирования осадка подкисленный фильтрат оставляют на 20-40 ч при 0-4^oС. Затем надосадочную жидкость декантируют, а для выделения осадка проводят центрифугирование при 3000 об/мин в течение 20 мин. К полученному осадку добавляют этанол (для консервации и хранения). Для получения концентрата (порошка), содержащего нуклеопротеиновые комплексы, суспензию, хранящуюся под этанолом, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин, промывают этанолом, ацетоном и серным эфиром, фильтруют и высушивают под током теплого воздуха.

Выход конечного продукта (порошка нуклеопротеинового комплекса) составляет 2,5-3,0% от количества исходного сырья.

Порошок нуклеопротеинового комплекса из органов и тканей, полученный описанным способом, относится к группе малорастворимых веществ (ГФ Х1, вып. 1, с. 175-176).

Препарат нетоксичен и соответствует медико-биологическим требованиям и санитарным нормам качества продовольственного сырья и пищевых продуктов, утвержденных Минздравом СССР 01.08.89 N 5061.

Определение содержания в полученном продукте нуклеопротеиновых комплексов осуществляют по следующим показателям: содержание белка, содержание нуклеиновых кислот, молекулярная масса составляющих компонентов.

Содержание белка в продукте определяется методом, основанном на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот и цистеина с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи.

Содержание нуклеиновых кислот в продукте определяется методом, основанном на определении содержания фосфора в продукте (в виде фосфорного ангидрида) и последующем расчете количества нуклеиновых кислот.

Молекулярную массу компонентов, входящих в состав продукта, определяют методом ступенчатого электрофореза в полиакриламидном геле.

Предлагаемая технология в отличие от известных позволяет получить продукт с повышенной биологической ценностью, который содержит нуклеопротеиновые комплексы, обладающие высокой избирательностью (специфичностью) действия и тропностью по отношению к органам и тканям, являющихся источником их получения. Это позволяет использовать получаемые нативные комплексы для оптимизации внутриклеточного метаболизма и улучшения усвоения продуктов питания.

Ниже приведены примеры получения нуклеопротеиновых комплексов из животного сырья, в качестве которого используют различные органы и ткани животных.

Пример 1. В качестве животного сырья предлагается использовать простату крупного рогатого скота.

Сырье (простата-железа) в количестве 300 г измельчают, заливают 3 л 1,0% -ного раствора соды (углекислого натрия), что соответствует соотношению объемов сырья к раствору углекислого натрия 1:10 и добавляют 3 г (0,1%) МgСl₂. Раствор перемешивают до установления рН 10,4-10,6. Экстракцию проводят в течение 4 ч при непрерывном перемешивании. После этого экстракт (надосадочную жидкость) отделяют фильтрацией или на центрифуге. Для осаждения нуклеопротеинового комплекса в экстракт при перемешивании порционно добавляют уксусную кислоту (33%). Осаждение проводят до рН 3,8. Затем образовавшуюся суспензию (с целью более полного осаждения комплекса) охлаждают при 4^oС в течение 40 ч. Надосадочный слой удаляют декантированием. Сформировавшийся осадок отделяют от надосадочной жидкости центрифугированием.

Масса полученного влажного осадка (пасты) составляет 5,9 г.

Полученную пасту промывают органическими растворителями (последовательно этанолом, ацетоном и серным эфиром), после чего высушивают при 39±1^oС до полного удаления запаха органических растворителей и подвергают обработке в водяной бане при 40-50^oС до получения рыхлого мелкого порошка.

Идентификацию продукта проводят с помощью ультрафиолетовой спектрофотометрии. Порошок в количестве 10 мг растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора до водной метки. Компоненты, входящие в состав продукта, дают поглощение соответственно при 230 нм 2,4, при 260 нм 1,24 и при 280 нм 0,84, что характерно для веществ нуклеопротеиновой природы.

Содержание белка в продукте определяют по методу Лоури с применением реактива Фолина-Чикольтау.

К 1 мл испытуемого раствора добавляют 2 мл 0,5 Н раствора NаОН и 0,6 мл реактива Фолина, разведенного водой 1:2. Через 20 мин измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 670 нм (против воды). Для калибровки используют сывороточный альбумин (человеческий) фирмы Реанал (Венгрия).

Содержание нуклеиновых кислот в продукте определяют методом, основанном на выявлении фосфора (в виде фосфорного ангидрида) и последующем расчете количества нуклеиновых кислот. Для определения содержания фосфора навеску препарата нагревают в смеси серной и азотной кислот, далее полученный раствор разбавляют дистиллированной водой до 250 мл. Содержание фосфора определяют в виде хинолята фосфорно-молибденовой кислоты. Для этого аликвотную порцию раствора разбавляют 0,1 Н НСl до 2000 мл и добавляют 25 мл концентрированной соляной кислоты. Смесь нагревают до кипения и при перемешивании добавляют осаждающую смесь, состоящую из 15 мл концентрированной соляной кислоты, 25 мл 10%-ного раствора молибдата аммония и 25 мл 2%-ного раствора хинолина. Раствор с образовавшимся осадком выдерживают на водяной бане 20 мин и фильтруют через тигель с пористым дном N 16. Осадок промывают 2%-ным раствором соляной кислоты и сушат при 140-150^oС до постоянного веса.

Содержание фосфора рассчитывают по формуле:
Р₂О₅ А•0,0321•V•100/Р•V₁
где А масса хинолята фосфорно-молибденовой кислоты, г,
V общий объем раствора, мл,
V₁ аликвотная часть раствора, мл,
Р навеска образца, г.

Концентрацию нуклеиновых кислот (НК) в препаратах определяют в расчете на среднюю молекулярную массу нуклеиновой кислоты-монофосфата:
НК 2B•339/142,
где В содержание Р₂О₅
142 молекулярная масса Р₂О₅,
339 средняя молекулярная масса НК основания.

Молекулярную массу компонентов, входящих в состав продукта, определяют с помощью ступенчатого электрофореза в полиакриламидном геле по общепринятой методике.

Навеску 3 мг растворяют в 3 мл 0,0125 М трис буфера при рН 6,8 с добавлением 2% додецилсульфата и 5% меркаптоэтанола. Пробу центрифугируют и наносят на гель в количестве 10-15 мкл. Разделение белков проводят в щелочном буфере при рН 8,3, силе тока 20-30 мА в течение 5 ч. Окраску зон проводят раствором Кумасси R-250.

Основные характеристики полученного комплекса из простаты представлены в табл. 1.

Пример 2. В качестве животного сырья предлагается использовать кору головного мозга (серого вещества) крупного рогатого скота.

Сырье (кора головного мозга) в количестве 5 кг измельчают, заливают 40 л 1,0% -ного раствора соды (углекислого натрия), что соответствует соотношению объемов сырья к раствору углекислого натрия 1:8 и добавляют 160 г (0,4%) МgCl₂. Раствор перемешивают до рН 10,4-10,6. Экстракцию проводят в течение 4 ч при непрерывном перемешивании. после этого экстракт (надосадочную жидкость) отделяют фильтрацией или на центрифуге. Для осаждения нуклеопротеинового комплекса в экстракт при перемешивании порционно добавляют уксусную кислоту (33% ). Осаждение проводят до рН=4,2- 5,5. Затем образовавшуюся суспензию (с целью более полного осаждения комплекса) охлаждают при 4^oС в течение 40 ч. Надосадочный слой удаляют декантированием. Сформировавшийся осадок отделяют от надосадочной жидкости центрифугированием.

Масса полученного влажного осадка (пасты) составляет 120-150 г.

Полученную пасту промывают органическими растворителями (последовательно этанолом, ацетоном и серным эфиром), после чего высушивают при 39±1^oС до полного удаления запаха при 40-50^oС до получения рыхлого мелкого порошка.

Основные характеристики полученного комплекса из коры головного мозга, определенные методами, описанными в примере 1, представлены в табл. 2.

Пример 3. В качестве животного сырья предлагается использовать семенники крупного рогатого скота.

Сырье (семенники) в количестве 3,5 кг измельчают, заливают 40 л 2,5%-ного раствора соды (углекислого натрия), что соответствует соотношению объемов сырья к раствору углекислого натрия 1:20 и добавляют 140 г (0,2%) МgCl₂. Раствор перемешивают до рН= 10,6. Экстракцию проводят в течение 4 ч и при непрерывном перемешивании. После чего экстракт (надосадочную жидкость) отделяют фильтрацией или на центрифуге. Для осаждения нуклеопротеинового комплекса в экстракт при перемешивании порционно добавляют уксусную кислоту (33% ). Осаждение проводят до рН=4,4. Затем образовавшуюся суспензию (с целью более полного осаждения комплекса) охлаждают при 4^oС в течение 40 ч. Надосадочный слой удаляют декантированием. Сформировавшийся осадок отделяют от надосадочной жидкости центрифугированием.

Масса полученного влажного осадка (пасты) составляет 42 г.

Полученную пасту промывают органическими растворителями (последовательно этанолом, ацетоном и серным эфиром), после чего полученную пасту высушивают при 39±1^oС до полного удаления запаха органических растворителей и подвергают обработке в водяной бане при 40-50^oС до получения рыхлого мелкого порошка.

Основные характеристики полученного комплекса из семенников, определенные методами, описанными в примере 1, представлены в табл. 3.

Пример 4. В качестве животного сырья предлагается использовать тимус крупного рогатого скота.

Сырье (тимус) в количестве 3,0 кг измельчают, заливают 60 л 2,0%-ного раствора соды (углекислого натрия), что соответствует соотношению объемов сырья к раствору углекислого натрия 1:20 и добавляют 300 г (0,5%) МgCl₂. Раствор перемешивают до рН=10,5. Экстракцию проводят в течение 4 ч при непрерывном перемешивании. После чего экстракт (надосадочную жидкость) отделяют фильтрацией или на центрифуге. Для осаждения нуклеопротеинового комплекса в экстракт при перемешивании порционно добавляют уксусную кислоту (33%). Осаждение проводят до рН=4,7. Затем образовавшуюся суспензию ( с целью более полного осаждения комплекса) охлаждают при 4^oС в течение 40 ч. Надосадочный слой удаляют декантированием. Сформировавшийся осадок отделяют от надосадочной жидкости центрифугированием.

Масса полученного влажного осадка (пасты) составляет 80 г.

Полученную пасту промывают органическими растворителями (последовательно этанолом, ацетоном и серным эфиром), после чего высушивают при 39±1^oС до полного удаления запаха органических растворителей и подвергают обработке в водяной бане при 40-50^oС до получения рыхлого мелкого порошка.

Основные характеристики полученного комплекса из тимуса, определенные методами, описанными в примере 1, представлены в табл.4.

Пример 5. В качестве животного сырья предлагается использовать печень крупного рогатого скота.

Сырье (размороженный фарш печени) в количестве 4,5 кг измельчают, заливают 67,5 л 2,5%-ного раствора соды (углекислого натрия), что соответствует соотношению объемов сырья к раствору углекислого натрия 1:15 и добавляют 202,5 г (0,3%) MgCl₂. Раствор перемешивают до рН=10,6-10,8. Экстракцию проводят в течение 4 ч и при непрерывном перемешивании. После чего экстракт (надосадочную жидкость) отделяют фильтрацией или на центрифуге. Для осаждения нуклеопротеинового комплекса в экстракт при перемешивании порционно добавляют уксусную кислоту (33%). Осаждение проводят до рН= 4,3. Затем образовавшуюся суспензию (с целью более полного осаждения комплекса) охлаждают при 4^oС в течение 40 ч. Надосадочный слой удаляют декантированием. Сформировавшийся осадок отделяют от остатков надосадочной жидкости центрифугированием.

Объем полученного влажного осадка пасты составляет 110 г.

Полученный объем пасты промывают органическими растворителями (последовательно этанолом, ацетоном и серным эфиром). После чего полученную пасту высушивают при 39±1^oС до полного удаления запаха органических растворителей. Полученную пасту подвергают обработке в водяной бане при 40-50^oС до получения рыхлого мелкого порошка.

Основные характеристики полученного комплекса из печени, определенные методами, описанными в примере 1, представлены в табл. 5.

Полученные вышеописанным способом продукты представляют собой комплекс нуклеопротеинов, специфичных для тканей и органов, из которых они выделены. Именно это обстоятельство объясняет тканеспецифическое действие физиологически активных веществ нуклеопротеиновой природы, которые при использовании в качестве диетических дополнений к нормальному питательному рациону, проявляют укрепляющее и регулирующее действие на организм за счет непосредственной тканевой ассимиляции.

Биологически активный нуклеопротеиновый комплекс, полученный заявляемым способом, рекомендуется использовать в качестве диетических дополнений (пищевых добавок) к нормальному питательному рациону в виде капсул, таблеток, покрытых кишечнорастворимой оболочкой, порошка в желатиновых капсулах, пастилок, иммобилизованных в желе, а также в составе жевательной резинки.

При этом одна таблетка, покрытая кишечнорастворимой оболочкой, капсула, пастилка и т.д. содержит от 1 до 100 мг биологически активного нуклеопротеинового комплекса (концентрата).

Полученные биологически активные нуклеопротеиновые комплексы, обладающие высокой избирательностью (специфичностью) действия по отношению к органам и тканям, из которых они выделены, рекомендуется применять как пищевую добавку внутрь за 10-15 мин до еды по 1-3 таблетки (капсулы, пастилки и т.д.) 2-3 раза в день в течение 10-15 дней. Рекомендуется повторный курс через 3-6 месяцев.

Использование: в технологии получения белковой пищевой добавки. Сущность изобретения состоит в получении белковой пищевой добавки способом, предусматривающим экстракцию подготовленного животного сырья (измельченных замороженных органов и тканей млекопитающих) с использованием в качестве экстрагента 1-2,5% раствора углекислого натрия при рН = 10,4-10,8 в течение 2-4 ч с добавлением 0,1-0,5% хлористого магния. Соотношение объемов экстрагируемой ткани и раствора соды находится в диапазоне от 1:8 до 1:20. Затем проводят отделение осадка фильтрацией или на центрифуге, подкисление экстракта до рН = 3,8-5,5 удаление балластных веществ, промывание осадка органическими растворителями и высушивание осадка при температуре не выше 55^oС. 5 табл.

1. Способ получения белковой пищевой добавки, предусматривающий замораживание и измельчение сырья животного происхождения, экстрагирование биологически активных веществ водно-солевым раствором, удаление балластных веществ и концентрирование экстракта высушиванием, отличающийся тем, что в качестве водно-солевого раствора используют 1 2,5%-ный раствор углекислого натрия при соотношении объемов сырья и раствора углекислого натрия в пределах от 1:8 до 1:20, экстрагирование проводят при рН 10,4 10,8 в течение 2-4 ч в присутствии хлористого магния в количестве 0,1 0,5% после чего полученный экстракт подкисляют до pН 3,8 5,5, после удаления балластных веществ осуществляют промывку осадка органическими растворителями, а высушивание ведут при температуре не выше 55^oС. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что молекулярная масса входящих в добавку нуклеопротеиновых компонентов находится в пределах 10000 90000 Да.