Способ получения липазы Советский патент 1984 года по МПК C12N9/20 

1 Изобретение относится к способам получения ферментов из растительных источников и может найти применение в пищевой и фармакологической ,промышленностях и. медицине. Известен способ получения липазы из поджелудочной железы методом аффинной хроматографии 1J . Недостатком данного способа явля ется необходимость исполь.зования дефицитного сырья. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения липазы из семян хлопчатника, включакмций их проращивание, измельчение проростков, обработку ацетоном,.экстракцию белков из ацетонового порошка и оса:жде ние липазы сульфитом аммония 21. Недостатками известного способа являются низкий выход и невысокая каталитическая активность целевого продукта. Цель изобретения - увеличение; каталит:ической активности и выхода липазы. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения липазы из семян хлопчатника, включающему их проращивание, измельчение проростков, обработку ацетоном, экстракцию белков из ацетонового порошка и осалдение липазы сул фатом аммония, семена перед проращи ванием выдергивают в течение суток в 0,0,р1-0,03%-ном растворе пирофосфата натрия, а затем проращивают в тех же условиях в течение 4-6 сут. Способ осуществляют следующим Образом. Семена замачивают и проращивают в 0,001-0,03%-ном растворе пирофосф та натрия. Время замачивания опреде ляют по времени до начала прорастания семян (семена прорастают через сутки), затем семена отделяют друг от друга и помещают на фильтровальную бумагу, смоченную пирофосфатом натрия. Через 2 сут их опять помещают в сосуд с раствором пирофосфата натрия и через каждые сутки беру V пробы и измеряют активность. В табл. 1 представлена зависимость активности липазы от времени вьщерживання семян в пирофосфате. 942 в табл. 2 - активность и выход липазы в зависимости от условий проращивания семян, в табл. 3 - активность очищенной липазы после сульфатного осаждения, в табл. 4 - влияние различных фосфатов на активность липазы. Данные табл.4 свидетельствуют, что использование вместо пирофосфата натрия других фосфатов не приводит к достижению максимального положительного эффекта. Пример 1. 100 г семян хлопчатника сорта 108-Ф замачивают в 35 мл 0,,003%-ного раствора пирофосфата натрия в течение 24 ч, оставляют в термостате при 25-27 С. Через сутки наклюнувшиеся семена раскладывают между листами фильтровальной бумаги, увлажненной пирофосфатом натрия, и вьщерживают еще 2 сут при 2527 С. Затем проростки помещают в сосуд с О,003%-ным раствором пирофосфата натрия. Через 6 сут семена размельчают в среде холодного ацетона, промывают ацетоном и высушивают на воздухе. Порцию приготовленного таким способом порощка суспендируют в 0,.1 М фосфатном буферном растворе в соотношении 1:10 при перемешивании в течение 1ч при 0-5°С. Растворимые белки отделяют центрифугированием в течение 15 мин. Осадок отбрасывают, а к полученному супернатанту добавляют сульфат аммония до концентрации 55% от насьщения. Осадок липазы отделяют центрифугированием, растворяют в том же буфере и высу1ЕЕИвают, активность 3,25,76 ед/мг, выход 172,3%. Полученная липаза белая, порошковидная, без запаха. Состав: белок 93%, вода 7%. Пример 2. Проводят по примеру 1, но берут 0,001%-Hbrii раствор пирофосфата и вьщерживают семена 4 сут. При концентрациях ниже 0,001% и вьлпе 0,03% стимулирующее действие пирофосфата незначительно. Использование предлагаемого способа позволяет увеличить выход липазы в 1,2-2,2 раза, а удельную каталитическую активность в 1,63,4 раза. Каталитическая активность, ед/мг белка 32,0 . 40,72 Общая активность, ед/мг 672 896 Выход по отношению к исходной активрости, % 161,5 215,3 9,56 18,46 480 480 115,3

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПАЗЫ из семян хлопчатника, включаюпщй их прорапрвание, измельчение проростков, обработку ацетоном, экстракцию белков из ацетонового порошка, осаждение липазы сульфатсм аммония, отличающийся тем, что, с целью увеличения каталитической активноети и выхода липазы, семена перед проращиванием вьщерживают в течение одних суток в 0,001-Oj03%-HOM растворе пирофосфата натрия, а затем проращивают в тех же условиях в течение 4-6 сут.

Концентрация пирофосфата натрия, %

Показатели

0,001 0,003 I 0,01 0,03 Каталитическая активность, 256,0 Общая активность, ед/мг 357,6 Выход по отношению к исходной активности (416 ед/мг), %., 129,0

Таблица 3

Предлагаемый способ

Известный способ 325,76 156,72 147,68 95,04 716,8 384,0 384,0 332,0 172,3 93,3 92,3 80

51122694

Таблица 4

натрад

132

натрия 386,2

Продолжение табл.4

Триполифосфат натрия

280,2 0,003%

Полифосфат натрия

241,1 0,001%

Без фосфатов 114,2