Штамм @ @ А-60-продуцент биологически активного комплекса липидов и способ получения биологически активного комплекса липидов Советский патент 1984 года по МПК A61K38/01 A61K35/68 

;о ел ел Изобретение относится к микробиологическому производству биологически активных веществ - липидов, используемых в медицине, веtepинapии и парфюмерии. Известно использование в каче.стве источника липидов смеси различ ных субстратов, включающей бактерии различных видов и дрожжеподобные организмы р. Известен также способ получения биологически активного комплекса липидов, включающий культивирование посевного материала при аэрации на среде, содержащей источ1тк углерода, минеральные соли, витамины и воду, сепарирование, экстракцию пол ченной биомассы смесью хлороформаметанола 2:1, очистку вьщеленйого экстракта йромывкой дастилли юван- ной водойи последующее высушивание Однако использование известной смешанной культуры и способа получения из нее биологически активного комплекса липидов не обеспечивают достаточный выход и активность целевого продукта. Цель изобретения - повьшение выхода и активности целевого продукта. Поставленная цель достигается те что используют штамм Astasia Ibnga А-60 (коллекция Московского Государ ственного Университета им. М.В.Ломо носова) .в качестве продуцента биологически активного комплекса липидов. Кроме того, согласно способу по лучения биологически активного комплекса липидов, включающему культивирование посевного материала при аэрации на среде, содержащей источник углерода, минеральные соли,, витамины и воду, сепарирование,экстра цию полученной биомассы смесью хлороформа-метанола 2:1, очистку выделенного экстракта промывкой дисти лированной водой и последующее высушивание, в качестве продуцента ис пользуют штамм простейшего Astasia longa № А-60, аэрацию проводят при режиме 2.,0-2,5 объема воздуха в 1 ми на 1 л среды, при этом посевной материал вьфащивают на круговой качал ке при 220-250 обУмин. Полученный штамм Astasia longa №А имеет следующую морфологическую и ф зиологическую характеристики: Astas longa имеет длинуклетки 30-40 мк и ширину 6-10 мк. Цитоплазма заполнена парамилоном, которьй скрывает внутриклеточные структуры. Astasia longa - свободноживущий хегутиконосец, подцарство Protozoa, класс Flagellata порядок Englenomonada. Размножается бесполым путем (бинарное деление). Морфологическая характеристика: одноклеточньй организм, имеющий удлиненную, почти цилиндрическую форму, задний .конец которого снабжен сосковидным отростком. Снаружи клетка покрыта оболочкой (пелликулой). Передний конец снабжен жгутом. Жгут является основным органом передвижения флагеллят. Astasia longa характерно присутствие хорошо оформленного ядра. Ядро имеет сферическую форму диаметром 4 мк. На тонких срезах Astasia longa обнаружены рибосомы. А.longa имеет хорошо развитую цитоплазматическую сеть. Имеет комплекс Гольджи, состояsifiu из параллельных пластинок. Физиологическая характеристика: по способу питания сапрофит, хемогетеротроф. Отношение к углеводам: не использу.ёт глюкозу и другие углеводы. Отношение к спиртам: использует этиловый спирт как источник углерода и энергии. Отношение к органическим кислотам: использует пропионовую, масляную, валериановую, капроновую, пировиноградную кислоты, как источник углерода и энергии. Оптимальный источник углерода - этанол. Отношение к органическим веществам: не использует аминокислоты. Оптимальным источником азота являются аммонийные соли. Способ поясняется примерами. Пример 1. Для выращивания , посевного материала готовят среду следующего состава, вес,%: этиловый спирт, ректификат 1,19; KHjPO 0,043; (NH4)HP04 0,062; 5Е„0 0,043, MgeOo 0,0008;CaCl 20,001; микроэлементы Peg (5 0 ) 9 9Н20 0,0001; Cu504 0,0001;CoCej-6H20 0,0001} 7HjO 0,00002; Na MoO -2H20 0,00001; витамин B 0,002; витамин B;,2 0,00001; дистиллированная вода - остальное, начальное значение рН 6,8. Среду разливают в качалочные колб по 250 МП и стерилизуют при 1 атм 30 мин. Перед засевом рреды добавляют необходимые количества этилового спирта и витаминов. Колбы засевают культурой A.longa А-60 в количестве 10% от исходного объема среды при накоплении клеток 5-10 в одном мл. Колбы помещают на качалку с числом оборотов 220 об./мин и встряхивают 6 сут. По окончании процесса колбы снимают, отбирают пробы. В пробах определяют число клеток и содержание липидов в них. Число клеток составляет 10.«10 в одном мл среды,количество липидов 8% веса сухих кле ток. Для проведения выращивания A.longa в ферментерах в объеме 60 л готовят среду следующего состава,вес.% этиловьй спирт гидролизньй 1,19 КН2Р04 0,043; (NH4)2 НРО, 0,062; ( 0,043; 0,0008; витамин В 0,0002; витамин 3,0,0001 водопроводная вода остальное, начальное значение рН 6,8. Среду стерилизуют при 1 атм 1ч. Перед посевом добавляют спирт этиловый ГИДРОЛИЗНЫЙ и витамины. Фермен тер засевают культурой продуцента в количестве 5% от исходного объёма при накоплении клеток 10-10 в одном мл среды. Устанавливают режим аэриро вания 2,0 объема воздуха на 1 объем среды в 1 МИН. По истечении 6 суток отбирают пробы, в которых определяют число клеток и количество липидов. Число клеток составляет 12-10 в рд-ном мл среды. Количество липидов 12% веса сухих клеток. Клетки сепарируют а из полученной сырой биомассы, количество которой составляет 60 г на один литр среды, выделяют липиды Для этого 200 г ,био 1ассы переносят в стеклянную колбу, добавляют экстракционный раствор, состоящий из смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:1, в количестве 2 л (на 1 г биомассы необходимо 10 мл смеси). Полученную смесь ставят на качалку на 10 ч. Экстракцию проводят при ком натной температуре и постоянном встр хивании . Лизированные клетки отфильт ровывают. К полученному экстракту до бавляют 1/5 объема 0,74%-ного водного раствора КСЁ. Смесь ставят на качалку на 2-5 мин для встряхивания Переносят в химический стакан и зали вают Дистиллированной водой. После расслоения экстракта на две фазы: верхнюю - водно-метанольную, нижнюю хлорофорМенную стакан помещают на дно большего по объему сосуда, также заполненного дистиллированной водой для удаления нелипидньх водорастворимых примесей. Сосуд оставляют на холоду ,в течение 12 ч. Затем верхнюю фазу из химического стакана осторожно удаляют сифоном. Пограничньй слой, состоящий из липопротеидов, растворяют метанолом. Метанол добавляют небольшими порциями по 5-10 мл до полного растворения белого осадка липопротеидов. Экстракт высушивают над сернокислым натрием 24 ч и отфильтровывают . Органический растворитель отгоняют на роторном испарителе в вакууме при 10-20. мм рт.ст, и температуре 40-45с. Остаток в колбе представляет собой общую липидную фракцию простейшего A.longa. Целевой продукт имеет следуюшрй состав, %: фосфолипиды 38,5 стерины . 6,2J мрноглицериды 2 диглицериды 6; свободные жирные кислоты 7, триглицериды 34,5; эфиры стеринов 8. Пример 2.. Для приготовления посевного, материала готовят среду, как это указано в примере.1. Колбы засевают культурой A.longa А-60, помещают на круговую качалку с числом оборотов 250 и встряхивают 6 сут. Отбирают пробы, определяют число клеток в одном мл среды и количество липидов. Число клеток составляет 12-10 в одном мл среды, количество липидов 10% веса сухих клеток. Для проведения выращивания A.longa А-60 готовят среду следующего состава, вес.%: этиловый спирт гидролизный 1,20; KH,jPO 0,046, (МН)НРО 0,064; 0,046; 0,00084, витамин В, 0,00026; витамин 0,000014 водопроводная вода остальное, начальное значение рН 6,8, Далее проводят все операции, как это указано в примере 1, Устанавливаг ют режим аэрации 2-, 5 объема воздуха на один объём среды в.минуту. По истечении 6 сут отбирают пробы, в которых определяют число клеток и количество липидов. Число клеток составляет 14,-10 в одном мл среды, количество липидов - 14% веса сухих клеток. Клетки сепарируют, из сьфой

S 11289556 . ,

биомассы 66 г, вьщеляют липиды, какдержанием aKtHBHbix компонентов - поэто указано в примере 1. Целевойлиеновых жирных кислот (больше в

продукт имеет следующие характерис-1,5 раза), фосфолипидов - в 2 раза

тики: липидов 13% веса сухих клеток.больше, снизить продолжительность

Далее клетки сепарируют и вьделяют5 культивирования со 168-193 ч до 144,

липиды,как в примереМ.заменить пищевое сырье (спирт рекПредпагаемьш штамм и способ полу-тификат) на непищевое (спирт гидчения из него биологически активно-ролизный), снизить себестоимость

го комплекса липидов позволяет полу-1 кг целевого продукта в 2,0-2,5 раза

чить целевой продукт повьшенным со-Ю по сравнению с прототипом.

1. Штамм Astasia longa А-60 , (коллекдая Московского Государственного Университета им. В.М.Ломоносова)продуцент биологически активного комплекса липидотз. 2. Способ получения биологически активного комплекса липидов, включакщий культивирование посевного материала при аэрации на среде, содержащей источникуглерода, минеральные соли, витамины и воду, сепарирование, экстракцию полученной биомассы смесью хлороформа - метанола 2:1, очистку выделенного экстракта промывкой дистиллированной водой и последующее высушивание, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и активности целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм простейшего Аз- tasia longa № А-60, аэрацию проводят при режиме 2,0-2,5 объема возсл духа в 1 мин на 1 л среды, при этом посевной материал выращивают на круговой качалке при 220-250 оборотах в 1 мин.